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研究目的:在全球女性患者中,乳腺癌是最常诊断的肿瘤,其死亡率也非常高,这与乳腺癌丰富的血管生成密不可分。肿瘤的血管生成模式大体可以分为两种:内皮依赖性血管和肿瘤血管生成拟态(vasculogenic mimicry)。肿瘤血管生成拟态是指由肿瘤细胞维成管道为自己提供能量的方式,这些肿瘤细胞同时具有肿瘤细胞和内皮细胞的标志物。在很多肿瘤中证实,由于血管生成拟态的出现,导致病人不良预后。磷酸鞘氨醇受体1(S1PR1)是一种含有382个氨基酸的蛋白质,在血管生成与淋巴转移中起到非常重要的作用。但是其在肿瘤血管生成中的研究很少,尤其是对肿瘤血管生成拟态(VM)中的作用更不明确。本研究探讨S1PR1在乳腺癌的血管生成模式中起到的调控作用,进一步阐明S1PR1对人乳腺癌中两种血管生成模式转换的作用机制,为乳腺癌的抗血管生成治疗提供新思路。研究方法:1.100例由两名资深病理医师确认诊断的乳腺癌病例及其组织标本,标本由天津医科大学总医院提供。通过免疫组织化学染色分析S1PR1在人体组织中的表达情况,进一步分析S1PR1的表达与临床病例资料中的病理学分期、分级、淋巴转移的关系。CD31/PAS双重染色法统计S1PR1的表达与VM及内皮依赖性血管的相关性。采用Kaplan-Meier法,进行生存分析。2.免疫组织化学染色法对100例乳腺癌组织中VE-cadherin、β-Catenin的表达进行检测,通过Pearson统计学方法分析S1PR1与VE-cadherin、β-Catenin的表达差异及其相关性。3.通过Western blot法,在乳腺癌细胞系中(MDA-MB-231、HS-578T、BT-474、MCF-7、T-47D)筛选出S1PR1本底高表达和低表达的细胞系,并用慢病毒转染法对S1PR1的表达进行干扰或过表达。用嘌呤霉素筛选出S1PR1乳腺癌稳转细胞系。4.通过三维培养观察内皮细胞与乳腺癌细胞共培养后的成管能力及乳腺癌细胞自身成管能力在各组间的差异。用MTT法检测内皮细胞与乳腺癌细胞共培养后各组内皮细胞的增殖活性情况。通过侵袭迁移、划痕实验观察S1PR1对乳腺癌细胞侵袭迁移及愈合能力的影响。5.在S1PR1转染后的乳腺癌细胞中,进行Western blot和免疫荧光实验,观察VE-cadherin、β-Catenin、EphA2的表达情况。6.通过Western blot实验检测S1PR1上下调之后VE-cadherin(Y731)位点磷酸化的改变,并用酶联免疫吸附试验(Elisa)检测其下游因子VEGF的表达情况。7.检测S1PR1转染过的乳腺癌细胞中RhoA的活性。加入RhoA抑制剂,并通过Western blot,三维培养及免疫荧光检测RhoA活性被抑制后,VE-cadherin(Y731)、VE-cadherin、β-Catenin的表达变化及成管情况。Elisa检测RhoA活性被抑制后的VEGF分泌情况。在加入S1PR1抑制剂后,再检测RhoA活性,以及下游因子表达情况。8.S1PR1稳转后的人乳腺癌细胞注射到裸鼠皮下,对肿瘤体积变化进行测量,并绘制肿瘤体积生长曲线。通过免疫组织化学染色及Endomucin/PAS双重染色检测肿瘤中S1PR1、VE-cadherin、β-catenin的表达情况,及内皮依赖性血管和VM的数量。研究结果1.在100例人乳腺癌组织中,63例(63/100)S1PR1高表达,其与肿瘤的分级(p=0.027)、转移(p=0.019)及VM(p=0.004)相关。Kaplan-Meier法分析得出,在非三阴乳腺癌中S1PR1的高表达与不良预后相关,而在三阴乳腺癌中没有显著差异。2.Pearson卡方检验显示S1PR1与VE-cadherin、β-Catenin的表达具有相关性,并且通过Pearson相关性分析得出S1PR1与VE-cadherin的表达负相关,S1PR1与β-Catenin的表达正相关(p<0.05),具有统计学意义。3.在五种乳腺癌细胞系中(MDA-MB-231、HS-578T、BT-474、MCF-7、T-47D)经过Western blot验证,挑选出S1PR1高表达的细胞系MCF-7,S1PR1低表达的细胞系MDA-MB-231。随后分别转入S1PR1的小干扰RNA和cDNA到MCF-7,MDA-MB-231细胞系,经过Western blot检测挑选出两个最佳的下调和一个上调。4.乳腺癌细胞系MCF-7下调S1PR1后,细胞的侵袭、迁移及管道形成均增强(p<0.05),而乳腺癌细胞系MDA-MB-231上调S1PR1后,细胞的侵袭、迁移及管道形成均减弱(p<0.05)。共培养中发现,MCF-7下调S1PR1组的内皮细胞细胞活性和成管能力都降低(p<0.05),而MDA-MB-231上调S1PR1组的内皮细胞细胞活性和成管能力都增强(p<0.05)。5.转染了S1PR1下调质粒的乳腺癌细胞系MCF-7的蛋白水平表现为,VE-cadherin、EphA2表达增高,β-Catenin表达降低(p<0.05)。而转染了S1PR1上调质粒的乳腺癌细胞系MDA-MB-231的蛋白水平表现为,VE-cadherin、EphA2表达降低,β-Catenin表达增加(p<0.05)。6.乳腺癌细胞系MCF-7下调S1PR1后,VE-cadherin(Y731)磷酸化减少,其分泌的VEGF减少(P<0.05)。乳腺癌细胞系MDA-MB-231上调S1PR1后VE-cadherin(Y731)磷酸化增多,其分泌的VEGF也增多(P<0.05)。7.在S1PR1高表达的MCF-7细胞及MDA-MB-231-S1PR1细胞中,RhoA的活性都相比对照组要高。在对本身S1PR1高表达的MCF-7细胞加入RhoA的抑制剂后发现,VE-cadherin的表达增加,而VE-cadherin(Y731)、β-Catenin的表达降低。加入RhoA的抑制剂使MCF-7细胞的成管能力更强,VEGF分泌减少。在肿瘤细胞中加入S1PR1的抑制剂与在肿瘤细胞中转染S1PR1下调质粒可以达到同样的实验结果。8.同对照组比较,MCF-7-sh-S1PR1组移植瘤生长快、肿瘤体积大,形成的VM管道多,肿瘤组织中VE-cadherin表达增加,β-Catenin表达减少。同对照组相比较,MDA-MB-231-S1PR1组移植瘤生长慢、肿瘤体积小,形成的VM管道少,肿瘤组织中VE-cadherin表达减少,β-Catenin表达增多。研究结论1.人乳腺癌组织中,S1PR1与乳腺癌的分期、淋巴转移及VM相关。在非三阴乳腺癌中,与病人不良预后相关。2.在体外实验中发现,S1PR1促进乳腺癌中内皮依赖性血管生成,抑制VM的发生,相对减慢了乳腺癌细胞的侵袭迁移能力。3.S1PR1通过诱导VE-cadherin(Y731)磷酸化,导致与其位点连接的β-Catenin脱落,从而促进VEGF分泌,内皮细胞更加活跃。4.在抑制RhoA后,S1PR1对VE-cadherin(Y731)磷酸化的诱导减弱,初步证实RhoA是S1PR1对VE-cadherin(Y731)磷酸化调控中的关键因子。5.在体内实验中,同组比较S1PR1的高表达与肿瘤内皮依赖性血管数量正相关,与VM和肿瘤大小负相关。