乳腺癌被认为是全球女性恶性肿瘤中最常见的癌症形式之一。在乳腺癌的所有治疗方法中,放疗和化疗是两种主要的临床治疗手段。尽管在不同的乳腺癌类型中采用不同的治疗方式,但是耐药性在所有乳腺癌类型中都很常见,是临床上的一大挑战。性类固醇激素在癌症发展和乳腺发育中起着至关重要的作用。雌激素是乳腺癌发生和发展过程中的主要调节因子。研究表明,雌激素降低或者抗雌激素策略对乳腺癌治疗具有积极的治疗效果,主要表现在雌激素受体依赖的乳腺癌类型中。在降低乳腺癌发病率的药物中,一种选择性雌激素受体调节剂-他莫昔芬,它能够作为ER拮抗剂发挥作用,对于ER阳性的乳腺癌中是非常有希望的治疗药物。尽管一系列的研究显示他莫昔芬可以显着降低女性乳腺癌的复发和转移的风险,但他莫昔芬引起的耐药性仍然是乳腺癌治疗中的一个世界关注点。内分泌治疗耐药性的产生是由于遗传（DNA序列的变化）和表观遗传因素引起的。目前,研究者们已经发现了几种对他莫昔芬产生耐药的机制,但是这对于理解乳腺癌中他莫昔芬耐药性的产生是远远不够的。因此,我们需要迫切探索乳腺癌中他莫昔芬耐药性的详细机制,为乳腺癌治疗找到新的突破口。目的1.为了揭示MCF7/TAMR细胞中他莫昔芬耐药性的关键调节因子,我们在他莫昔芬耐药性的MCF7/TAMR细胞和他莫昔芬敏感性的MCF7细胞中检测NEMP1的m RNA和蛋白质水平。此外,我们也在乳腺癌病人的癌旁正常组织和癌症组织中检测NEMP1的蛋白和m RNA水平。2.第一部分的结果发现NEMP1的蛋白和m RNA水平在乳腺癌组织中均升高,并且NEMP1的表达在他莫昔芬耐药的乳腺癌细胞系MCF7/TAMR中也显著上调。因此,第二部分主要是为了探讨NEMP1是否参与了对乳腺癌中他莫昔芬耐药性的调节。3.前面两部分的结果显示NEMP1与乳腺癌的发生高度相关,并且能够增强MCF7细胞对他莫昔芬产生耐药性。而研究表明核受体辅激活因子1也被认为是乳腺癌的关键调节因子,并且与乳腺癌的他莫昔芬耐药性正相关。总之,基于NEMP1和NCOA1是乳腺癌发展的两个潜在调节因子的假设,我们想要揭示这两个基因在乳腺癌发展中的具体分子机制。最重要的是,本研究的目的是为已经产生他莫昔芬耐药性的乳腺癌患者找到潜在的治疗靶点和可行的治疗策略。方法1.我们首先用4羟基他莫昔芬（他莫昔芬的活性代谢产物）处理MCF7细胞,一种雌激素受体阳性并且对他莫昔芬敏感的乳腺癌细胞系,以获得他莫昔芬耐药性的MCF7细胞系,命名为MCF7/TAMR细胞。通过MTT试验不同剂量的4羟基他莫昔芬处理96小时后MCF7和MCF7/TAMR细胞的增殖能力。接着,利用蛋白免疫印迹和实时定量PCR检测他莫昔芬敏感性MCF7细胞和他莫昔芬耐药性MCF7/TAMR细胞中NEMP1的蛋白和m RNA表达水平。此外,我们也通过免疫组织化学检测癌症病人中癌旁正常组织和乳腺癌组织中NEMP1的蛋白表达水平。而且,我们通过实时定量PCR检测了53个乳腺癌组织和18个配对的癌旁正常组织中NEMP1的m RNA水平。2.首先利用慢病毒包装系统获得MCF7/TAMR敲低NEMP1和MCF7过表达NEMP1的稳定细胞系,并且利用蛋白免疫印迹分别检测NEMP1敲低和过表达的效率。接着,利用细胞总数测定、MTT试验和克隆形成实验分别检测NEMP1敲低的MCF7/TAMR细胞和NEMP1过表达的MCF7细胞在他莫昔芬处理与未处理时的细胞状态。3.首先利用慢病毒包装系统获得MCF7/TAMR敲低NEMP1的稳定细胞系,然后在对照组细胞和敲低NEMP1的MCF7/TAMR细胞中利用实时定量PCR检测参与乳腺癌发生发展的主要调节因子HER2、EGFR、MYC、CCND1、PTEN、NCOA1、BCL2以及SRC的m RNA水平。另外,利用蛋白免疫印迹的方法检测对照组和敲低NEMP1的MCF7/TAMR细胞中NCOA1的表达水平。结果1.（1）结果显示,当4羟基他莫昔芬的浓度逐渐升高时,MCF7细胞的增殖能力显著受到抑制,并且呈现浓度依赖效应。而当4羟基他莫昔芬的浓度为0.2μM、0.5μM和1μM时,MCF7/TAMR细胞的增殖能力反而增强,并且细胞数目显著多于MCF7细胞。当4羟基他莫昔芬浓度为2μM时,与未加4羟基他莫昔芬相比,虽然MCF7/TAMR细胞增殖受到轻微抑制,但是细胞数目也多于增殖受到显著抑制的MCF7细胞。（2）蛋白免疫印迹和实时定量PCR结果显示,与MCF7细胞相比,NEMP1在MCF7/TAMR细胞中的蛋白和m RNA水平都显著升高。（3）免疫组织化学结果显示,与癌旁正常组织相比,在乳腺癌组织中NEMP1的表达显著升高。实时定量PCR结果显示,与癌旁正常组织相比,在肿瘤组织中发现NEMP1的m RNA水平显著升高。2.（1）蛋白免疫印迹结果显示,与对照组相比,sh RNA稳定表达的细胞中NEMP1的蛋白水平显著下调。（2）他莫昔芬处理或者未处理组之间对照组细胞的生长、增殖能力以及克隆形成能力都没有显著差异。然而,在NEMP1敲低后,与未处理组相比,他莫昔芬处理组中细胞的生长、增殖能力以及克隆形成能力被显著抑制。（3）蛋白免疫印迹结果显示,与对照组相比,稳定过表达NEMP1-CDS的MCF7细胞中NEMP1的蛋白水平显著上调。（4）在对照组细胞中,与未处理相比,他莫昔芬处理显著抑制了细胞的生长、增殖能力以及克隆形成能力。但是,在NEMP1过表达细胞中,他莫昔芬处理与未处理组之间细胞的生长、增殖能力以及克隆形成能力并没有明显差异。3.（1）与对照组细胞相比,在NEMP1敲低的MCF7/TAMR细胞中只有NCOA1的m RNA水平下降了,而其他的调节因子HER2、EGFR、MYC、CCND1、PTEN、BCL2以及SRC的m RNA水平的水平在两组之间并没有显著变化。（2）蛋白免疫印迹结果显示,在NEMP1敲低的MCF7/TAMR细胞中NCOA1的蛋白水平也显著下降。结论1.与MCF7细胞相比,MCF7/TAMR细胞对他莫昔芬产生了耐药性。并且,在MCF7/TAMR细胞中NEMP1的蛋白和m RNA的水平显著升高。此外,我们也发现了与癌旁正常组织相比,乳腺癌组织中NEMP1的蛋白水平和m RNA水平也显著升高,表明NEMP1与乳腺癌以及乳腺癌耐药性的产生密切相关。2.利用慢病毒系统,我们成功获得了NEMP1敲低的MCF7/TAMR细胞系和NEMP1过表达的MCF7细胞系。在NEMP1敲低的MCF7/TAMR细胞系中,通过细胞数目测定、MTT试验以及克隆形成实验,我们发现NEMP1的敲低抑制了MCF7/TAMR细胞的他莫昔芬耐药性。此外,在NEMP1过表达的MCF7细胞系中,我们发现NEMP1过表达降低了MCF7细胞对他莫昔芬的敏感性,增强了MCF7细胞对他莫昔芬的耐药性。3.在NEMP1敲低的MCF7/TAMR细胞中,结果显示只有NCOA1的m RNA水平下降了,而其他的调节因子如HER2、EGFR、MYC、CCND1、PTEN、BCL2以及SRC的m RNA水平在两组之间并没有显著变化。另外,我们也发现在NEMP1敲低的MCF7/TAMR细胞中NCOA1的蛋白水平也显著下降。这些实验结果表明,NEMP1是通过调控NCOA1的表达,从而调节MCF7/TAMR细胞中的他莫昔芬耐药性。