Toll样受体（TLRs）是一类I型膜结合蛋白,参与天然免疫反应,可以识别和防御入侵的病原体和微生物。至今为止,在哺乳动物中已经发现的TLRs家族成员有11个,其中,TLR2是一种关键的天然免疫受体,主要表达于多种免疫细胞和气道上皮细胞中,并被报道参与多种炎症性和免疫性疾病的发病过程。NLRC5是NOD样受体家族新发现的一种蛋白,能够调节炎症反应和细胞死亡。人与小鼠NLRC5均在肺、脾和胸腺中高度表达。大量研究表明,NLRC5在天然免疫中起着调节体内平衡的作用。在本论文中,我们主要针对NLRC5在TLR2介导的炎症反应和过敏性气道炎症中的参与调节作用进行探讨。一、NLRC5通过TLR2/NF-κB信号通路对脂磷壁酸（LTA）诱导的巨噬细胞炎症反应进行调节的分子机制研究研究背景NOD样受体（NLRs）是一类胞内模式识别受体（PRRs）,在宿主对病原相关分子模式（PAMPs）的防御中起作用。NOD样受体含CARD结构域-5（NLRC5）是其家族中最大的成员,它于2010年被首次发现,并相继证明能够在天然免疫及多种炎症反应中起关键性调节作用;此外,它亦能参与肿瘤的发生发展,并在其中起免疫监视作用。有可靠性研究表明,在体外,NLRC5可以负性调节TLR4介导的NF-κB的激活和I型干扰素的产生。TLR2与TLR4均为跨膜蛋白,能够参与多种炎性反应的发生发展,并起到调节作用,而NLRC5在体外是否亦能够参与TLR2介导的炎症反应,对其反应过程有着怎样的调节作用,目前尚未可知,仍需进行探究。研究目的1.探究在LTA诱导下,NLRC5在TLR2介导的巨噬细胞炎症反应过程中的变化情况。2.探讨NLRC5对TLR2介导的细胞炎症反应的调节作用,及其下游信号通路中可能存在的炎症调节潜在靶点。研究方法1.不同时间点LTA刺激巨噬细胞,观察TLR2、NLRC5及炎症相关信号分子的表达水平分别用相同浓度的LTA刺激小鼠单核巨噬细胞RAW264.7:0h、4h、8h、12h、24h。采用Western Blot方法检测TLR2、NLRC5及多种炎症相关信号分子的表达水平。2.通过siRNA在巨噬细胞中对TLR2进行干扰,并观察对LTA诱导的巨噬细胞炎症反应的影响,以及NLRC5表达水平的变化情况。在RAW264.7巨噬细胞中,行TLR2 siRNA干扰的同时,用LTA刺激细胞12h。采用Western Blot方法检测siRNA的敲减水平、NLRC5蛋白表达水平及巨噬细胞炎症反应水平在对TLR2敲减后的变化情况。通过对细胞行免疫荧光染色的方法,激光共聚焦显微镜观察NF-κB的入核分布情况及其表达水平的变化。3.通过siRNA对巨噬细胞中NLRC5进行靶向干预,观察其对LTA诱导下,TLR2介导的巨噬细胞炎症反应的调节作用,及TLR2表达水平的变化情况。用NLRC5 siRNA干扰RAW264.7巨噬细胞,对NLRC5靶向敲减后,用LTA刺激细胞12h。采用Western Blot方法检测siRNA的敲减水平、TLR2蛋白表达水平及巨噬细胞炎症反应水平在对NLRC5敲减后的变化情况。通过对细胞行免疫荧光染色的方法,激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞行NLRC5敲减后,对NF-κB的入核分布情况及表达水平变化的影响。研究结果1.LTA在RAW264.7细胞中诱导炎症反应和NLRC5的激活RAW264.7细胞在LTA刺激作用下,通过Western Blot检测发现炎症反应相关蛋白P-NF-κB p65、NLRP3、ASC的表达显著增加,同时,NLRC5的表达水平也在LTA的刺激下呈时间依赖性方式升高;与此同时,我们发现NLRC5的蛋白表达水平在12小时时达到峰值。2.LTA诱导NLRC5的激活是TLR2依赖的使用TLR2 siRNA对RAW264.7细胞进行敲减后,在LTA诱导下,巨噬细胞炎症反应显著减弱,Western Blot示炎症相关蛋白P-NF-κB p65、NLRP3、ASC的表达显著下调,同时,NLRC5的表达水平也随之降低。为了进一步证实这一结果,通过免疫细胞化学对NF-κB p65和P-NF-κB p65的表达水平进行检测,荧光成像结果显示,在对细胞进行TLR2敲减后,NF-κB p65的磷酸化水平明显减弱,P-NF-κB p65入核数量减少。3.NLRC5在TLR2介导的巨噬细胞炎症反应中能够负性调节炎症反应和NF-κB的激活在RAW264.7细胞中行NLRC5 siRNA敲减后,经LTA刺激细胞12h,免疫印迹分析显示,TLR2表达水平没有明显变化,但NF-κB p65的磷酸化水平在缺乏NLRC5的细胞中显著升高。此外,炎症小体相关蛋白质的表达,如NLRP3显著增加,然而ASC则显示表达降低。为了进一步进行验证,对NF-κB p65和P-NF-κB p65的表达水平行免疫细胞化学检测。荧光成像结果与免疫印迹分析结果一致。研究结论1.NLRC5参与LTA诱导下TLR2介导的巨噬细胞炎症反应。2.NLRC5在TLR2介导的巨噬细胞炎症反应中,通过对NF-κB信号通路的负性调节,来对炎症反应进行调控,这可能是一种新的天然免疫调节机制。二、在TLR2介导的小鼠过敏性气道炎症中,NLRC5参与并对其炎症可能的调节作用的机制探讨研究背景支气管哮喘（简称哮喘）作为一种严重的健康问题,全球的发病率和病死率仍保持持续增加。据估计,全球约有3.34亿人患有哮喘,预计到2025年全球总体患病人数将增加1个亿。其发病机制与气道慢性过敏性炎症反应和机体免疫异常有关。有哪些天然免疫反应能够通过TLR2激活,并在哮喘的发生发展中产生作用,目前仍然存在争议。此外,在哮喘发病中,未有研究针对NLRC5对过敏性气道炎症的参与情况及调节作用进行探讨,其与TLR2/NF-κB信号通路的交互作用也不甚清楚,相关机制有待研究。研究目的1.观察小鼠过敏性气道炎症模型中TLR2、NLRC5及炎症小体相关蛋白的表达情况。2.探讨在小鼠过敏性气道炎症中,NLRC5是否参与TLR2/NF-κB信号通路,并在其中起到怎样的调节作用。研究方法1.建立过敏性气道炎症模型,检测OVA诱导的C57小鼠肺组织中的TLR2、NLRC5的表达水平和气道炎症水平行鸡卵清蛋白（OVA）致敏并激发WT C57小鼠,建立过敏性气道炎症模型。采用Western Blot方法检测C57小鼠肺组织中TLR2和NLRC5的蛋白表达水平;苏木精伊红（HE）染色观察小鼠的气道壁厚度及气道壁周围炎性细胞浸润环数;过碘酸希夫（PAS）观察小鼠气道壁周围环状细胞增生和粘液分泌情况;瑞氏染色计数小鼠肺泡灌洗液（BALF）中的总细胞数及各类炎性细胞数目。2.TLR2基因敲除对小鼠过敏性气道炎症水平的影响评估对C57小鼠行TLR2基因敲除（TLR2-/-小鼠）,OVA分别致敏并激发TLR2-/-小鼠以及C57小鼠。通过组织病理学的方法,来观察分析小鼠在TLR2缺失后气道炎症表现的变化,HE染色分别观察C57和TLR2-/-小鼠气道壁厚度及气道周围炎性细胞浸润情况,PAS染色观察两组小鼠气道周围粘液分泌及杯状细胞增生;BALF液利用瑞氏染色法计数总细胞数及各类炎性细胞数目;酶联免疫吸附实验（ELISA）检测小鼠BALF中IL‐13,IL‐6,IFN‐γ,TNF‐α的水平。3.在小鼠过敏性气道炎症中行TLR2基因敲除对NLRC5蛋白表达水平和炎症相关蛋白表达水平的影响评估OVA分别致敏和激发C57小鼠和TLR2-/-小鼠,建立过敏性气道炎症模型。提取小鼠肺组织均浆提蛋白,提取的肺组织总蛋白行Western Blot方法检测,分析NLRC5蛋白表达水平变化,及对炎症小体相关蛋白表达水平的影响,评估NLRC5在TLR2介导的过敏性气道炎症中的参与情况和对下游炎症信号可能的调节作用。研究结果1.OVA诱导小鼠过敏性气道炎症伴TLR2和NLRC5表达增加与生理盐水对照组相比,受OVA刺激的C57小鼠,BALF液中的总细胞计数明显升高,同时各类炎性细胞数量均显著增加;组织病理学分析显示,实验组小鼠支气管管腔狭窄,有明显的炎性细胞浸润和粘液分泌;同时,免疫印迹分析示TLR2和NLRC5蛋白表达水平同气道炎症水平一致,均明显增加。2.OVA诱发的过敏性气道炎症在TLR2基因敲除小鼠中明显缓解在OVA致敏和激发条件下,与野生型C57小鼠相比,TLR2-/-小鼠肺组织组织病理学观察分析显示:小鼠支气管管腔增厚、炎性细胞浸润、粘液分泌及上皮杯状细胞增生均有明显减弱;BALF液中总细胞数及各类炎性细胞数量明显减少,ELISA检测BALF液中IL-6、IL-13及TNF-α炎症因子表达水平明显下调,而IFN-γ表达水平在TLR2-/-小鼠中则有所增加。3.TLR2基因敲除能明显降低过敏性气道炎症中炎症相关蛋白和NLRC5的表达水平在OVA致敏和激发下,野生型C57小鼠肺组织中NF-κB p65的磷酸化水平明显增高,炎症小体相关蛋白NLRP3、ASC表达水平亦同样升高;而TLR2-/-小鼠同野生型C57小鼠相比P-NF-κB p65、NLRP3和ASC等炎症相关蛋白表达水平显著下降,更重要的是,NLRC5的蛋白表达水平也随之明显减弱。研究结论1.NLRC5、TLR2及炎症小体相关蛋白均参与小鼠过敏性气道炎症2.NLRC5参与TLR2介导的小鼠过敏性气道炎症,并可能通过TLR2/NF-κB信号通路对过敏性气道炎症起调节作用。