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CV-A6(Coxsackievirus A6)能引起手足口病,并在近年来成为流行性手足口病的主要病原体,逐渐成为全球公共健康的威胁。CV-A6能感染人恶性胚胎横纹肌瘤细胞(RD)使其出现细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),并能够在其中增殖。但其极难以在人用疫苗细胞基质(如Vero细胞)上增殖。获得CV-A6的人用疫苗细胞基质适应株是目前工作的难点和重点所在。本课题旨在获得CV-A6于Vero细胞上的适应株,同时研究与CV-A6 Vero细胞嗜性和生长能力相关的位点。本课题基于实验室在前期研究中于襄阳2000余份样本中获得的8株CV-A6RD细胞适应株。通过在RD细胞上连续传代,最终于RD第16代获得了一株可在Vero细胞上生长的CV-A6适应株CV-A6-HEV3391/XY/2017株(下简称3391)。对3391-R16V6(RD细胞传至16代,Vero细胞传至6代)进行连续三轮的空斑纯化。通过对生长特性、抗原含量、病毒滴度等方面的比较,选取克隆株P49-21-21为骨架,合成cDNA,构建全长cDNA质粒,进行病毒拯救,获得了无RD细胞背景的CV-A6疫苗候选株rescue-3391(简称为res3391)。同时低感染复数传代,避免病毒在传代过程中的突变风险。为探究CV-A6与Vero细胞嗜性相关的关键位点,通过IFA对3391株之前在RD细胞上各代次的Vero细胞适应性突变株进行追溯,发现于R2代起已经出现Vero细胞嗜性的克隆株。对3391-R1进行连续3次末端稀释纯化,获得一对Vero细胞适应性存在差异的克隆株HEV3391-712-clone(下简称c712)株及HEV3391-1023-clone(下简称c1023)株。712株能同时在Vero细胞和RD细胞上生长,而1023株仅能在RD细胞上生长(下面表型简称为RD~+/Vero~+,RD~+/Vero~-)。对此两株进行病毒拯救获得拯救株rescue-712(下简称res712)和rescue-1023(下简称res1023)。通过全基因组测序及比对,发现二者在核苷酸上有4处差异,在氨基酸上存在两处差异。通过点突变,初步探究了这两个氨基酸位点对病毒细胞嗜性的影响,结果提示病毒细胞嗜性改变可能由多个位点影响。其次,为探究影响CV-A6在Vero细胞上生长能力的位点,对晚代次的res3391株与早代次res712于Vero细胞上的生长能力进行比较,res3391的滴度为res712株的400倍左右。通过全基因组比对,两者基因组之间存在14处核苷酸差异,差异相对较大。为确定与生长能力相关基因位点,通过两轮同源重组,首轮以res712为骨架,分别以res3391的P1段和P2&P3段进行替换,获得重组株recombine-712P1(下简称r712-P1)和recombine-712P2P3(下简称r712-P2P3)。且r712-P1株于Vero细胞上的滴度得到了显著提升,同时r712-P2P3株无明显改变。次轮首轮以res712为骨架,分别以res3391的VP1段和VP2-VP4段进行替换,获得重组株recombine-712VP1(下简称r712-VP1)和recombine-712VP2-VP4(下简称r712-VP24),但两者于Vero细胞上的滴度均无明显变化。此结果提示CV-A6于Vero细胞上的生长能力可能由位于P1段的多个位点决定,具体的相关位点尚需进一步研究。