目的:CBLL1是最近被发现的一个E3泛素连接酶,它含有RING-finger结构域。E-cadherin是典型的钙粘蛋白成员,它的缺失与癌的预后不良相关。CBLL1蛋白被确认为结合酪氨酸磷酸化的E-cadherin,介导其内化和随后的泛素依赖的降解从而改变细胞间接触。研究证明CBLL1在肿瘤发生中起多种作用。首先,CBLL1被报道可以诱导锚定-依赖的细胞生长;此外,在人类结肠癌组织中CBLL1在癌组织与正常组织相比表达明显增加。其次,在CBLL1过表达的上皮细胞表达E-cadherin shRNA不促进尖突起的形成,这表明CBLL1以E-cadherin非依赖的方式影响细胞的表型。CBLL1影响细胞对基质的粘附和MDCK上皮细胞的侵袭能力。在结直肠上皮细胞中,自分泌的Slit-Robo通路促进CBLL1介导的E-cadherin下调促进癌的发生。这些研究表明CBLL1可能是肿瘤进展中重要信号通路的下游蛋白,目前需要更多的研究来阐明CBLL1作为一个潜在的治疗靶点的作用。此外,CBLL1可以增加RNA结合蛋白PSF与癌症相关的蛋白质正常编码的mRNA结合的能力,并且促进MDCK细胞增殖。而在ERα依赖的乳腺癌MCF-7细胞中,CBLL1过表达可抑制雌激素依赖的细胞增殖和迁移。此外,东莉洁等研究发现CBLL1可以抑制HIF-1α/VEGF通路活性。总之,CBLL1在肿瘤形成中的潜在作用还需要进一步的研究。基于上述理由我们推测,CBLL1与癌症的进展有着密切的关系。为了验证我们的推测,探讨CBLL1对非小细胞肺癌的生物学作用,我们采用免疫组织化学方法检测CBLL1在非小细胞肺癌和癌旁肺组织中的表达,并结合临床资料分析其与临床病理特征之间的关系,上调和干扰CBLL1后对肺癌细胞增殖、侵袭的影响,探讨其可能的分子机制,为肺癌的早期诊断和治疗提供新的靶点。研究方法:1.肺癌组织标本本研究选取了中国医科大学附属第一医院2009年1月到2013年12月的79例肺癌组织和24例癌旁肺组织石蜡标本,均来自肺癌外科手术切除的患者,所有患者在手术前未接受放疗或者化疗。2.免疫组织化学染色、结果判定组织切片经二甲苯脱蜡,梯度酒精脱苯、水化后,采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法检测CBLL1蛋白表达。3.细胞培养人支气管上皮细胞HBE、肺腺癌细胞A549、H1299、SPC-A-1、H157。4.siRNA干扰和细胞转染根据siRNA设计原则,选取人CBLL1 mRNA中的特异性核苷酸片段为靶目标,由上海吉玛基因化学技术有限公司合成。分为非特异性siRNA转染组和特异性siRNA转染组,每个实验均重复三次,转染具体步骤按Lipofectamine 3000试剂说明书进行。CBLL1表达质粒pcDNA3.1-HA-CBLL1由Yasuyuki Fujita教授惠赠。具体转染步骤按脂质体Lipofectamine 3000试剂说明书进行,以转染空载体细胞作为对照。5.Realtime RT-PCR用RNAIso Plus提取细胞的总RNA后,进行逆转录实验,在ABI7900仪器上进行PCR反应。6.Western blot 10%SDS-聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶电泳,浓缩胶电压80伏特,分离胶电压120福特。恒压50伏转印120分钟。转膜结束后,进行封闭,一抗4℃孵育过夜,TTBS洗膜3次,每次10分钟,二抗室温孵育2小时,TTBS洗膜3次,每次10分钟。最后ECL发光。7.免疫荧光染色细胞爬片以后,4%多聚甲醛室温固定20min,PBS漂洗3次。染色步骤如下:5%BSA封闭2个小时,滴加一抗4℃孵育过夜,滴加FITC或TRITC标记山羊抗兔IgG,稀释比例为1:100,37℃孵育1小时,DAPI复染细胞核,37℃孵育8分钟。以PBS为阴性对照。8.CCK8法检测细胞增殖和体外集落形成实验细胞分别接种于4个96孔板培养板,培养第24、48、72小时分别加入CCK8 20μl,继续孵育2小时后在波长450nm测定各孔吸光度。实验重复3次。绘制细胞生长曲线。细胞计数后,培养12天,用PBS清洗2次,每次3分钟,苏木素染色后计数超过50个细胞的集落数。9.流式细胞仪检测细胞周期细胞处理48h小时后收集细胞,预冷PBS洗2次,2000rpm离心5分钟,弃上清,70%冷乙醇固定,4℃过夜。PBS洗2次去除乙醇,在细胞中加入RNaseA,37℃水浴锅处理30分钟,然后加入50mg/L的PI 1ml染色30分钟。用流式细胞仪进行DNA含量和细胞周期分析。10.基质胶侵袭实验（Transwell小室法）用预冷无血清RPMI1640培养基以1:7稀释Matrigel基质胶,吸取100μl稀释的Matrigel基质胶加入上室,下室加入含10%小牛血清的培养基600μl。2%小牛血清的培养基调至细胞密度为5×105个/ml,取100ul加入上室中。培养24小时后,固定,苏木素进行细胞染色。11.细胞划痕实验细胞转染24小时后,丝裂霉素处理2h,用10ul-100ul枪头比着井字,尽量垂至于背后的线划痕。PBS洗细胞3次,去除划下的细胞,加入无血清培养基。倒置显微镜拍照,培养24小时后拍照,实验至重复3次。12.统计学分析采用SPSS13.0统计学分析软件,对CBLL1表达与临床病理因素的关系用非参数检验;其它实验结果用均数±标准差（mean±SD）表示。采用t检验分析,P<0.05为有统计学意义。结果:1.CBLL1在癌旁肺组织的支气管和肺泡上皮中表达于细胞核,在肺癌组织中高表达。CBLL1的高表达与NSCLC患者的TNM高分期有关。2.CBLL1在非小细胞肺癌细胞系SPC、A549、H1299表达高于HBE细胞,H157中表达低于HBE细胞系。CBLL1在HBE细胞中表达在细胞核,A549和H1299的表达高于HBE,A549和H1299在细胞核和细胞浆都有表达。3.我们对CBLL1表达量中等的A549和H1299细胞系进行质粒转染和siRNA干扰,CBLL1表达水平相应有明显改变。4.CBLL1促进非小细胞肺癌细胞A549和H1299的增殖,促进细胞周期进程,干扰CBLL1表达后G0/G1期细胞比例增加。5.侵袭实验结果表明,肺非小细胞肺癌细胞系A549与H1299转染pcDNA3-HA-CBLL1后侵袭细胞数比转染pcDNA3-HA明显增加。肺癌细胞A549与H1299转染CBLL1 siRNA 1后侵袭细胞数比转染control siRNA明显减少。转染CBLL1 siRNA后,A549和H1299细胞的E-cadherin表达水平明显增加。划痕实验表明CBLL1促进肺癌细胞A549和H1299的迁移能力。结论:非小细胞肺癌中CBLL1高表达,并与pTNM分期和病理学类型有关,TNM分期高的肺癌患者组织中CBLL1高表达。CBLL1在非小细胞肺癌细胞中促进细胞的增殖、迁移和侵袭。