烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是一种在全球生态位广泛分布的丝状真菌,主要进行腐生和寄生生活,是人类主要的机会致病真菌,可造成免疫力低下或者缺陷人群感染致命的曲霉病,导致死亡。自1997年在美国加州报道第一例由于长期使用三唑类药物导致的烟曲霉耐药病例以来,此类病例数量逐年增长并呈全球分布趋势,成为曲霉病致死率增长的高危因素,给全世界公共卫生安全带来巨大风险。目前一般认为,烟曲霉耐药性的产生主要有三唑类药物的长期临床使用和三唑类杀菌剂的广泛农业使用两种途径。最常见的发生机制是真菌的抗唑类药物靶蛋白-甾醇14-去甲基化酶的编码基因cyp51A发生改变。在中国,有关烟曲霉耐药性的报道逐年增多,但由于有限的样本量和分布范围,对环境样本中烟曲霉耐药性的流行和监测研究尚处于起步阶段。云南是全球生物多样性的中心之一,也是中国的农业大省,多方位地了解云南地区环境样品中的烟曲霉耐药性情况以及群体遗传将为烟曲霉耐药性的流行和监测研究提供重要的科学依据。本文选择三个不同尺度的地理区域作为研究样本来源,从云南15个地州47个采样点的4700份土样中分离得到1043株烟曲霉,将其基因分型数据与全球烟曲霉数据库中的750株样本进行比较。一方面,通过体外药敏试验和cyp51A基因测序,对云南境内环境样品中的烟曲霉群体进行耐药性分析,旨在全方位地了解云南境内环境样品中的烟曲霉三唑类耐药性的流行情况和主要的发生机制,为科学、系统的评价环境中机会致病菌的耐药性状况提供科学依据;另一方面,通过STR（Short Tandem Repeat,短串联重复序列）分型,从群体遗传学的角度对分离自云南境内烟曲霉群体进行分析,旨在了解不同地理尺度的烟曲霉群体遗传多样性、种群结构、生殖模式以及与全球样本的遗传和进化关系。本研究将有助于揭示烟曲霉的流行病学特征和加深对该菌耐药性进化的理解。主要研究结果如下:1.云南晋宁蔬菜大棚是烟曲霉三唑类耐药性发生的热点,发现了药物作用靶标基因cyp51A的多种启动子突变类型。从昆明晋宁9个蔬菜大棚的900份土样中共分离得到烟曲霉233株,78.97%（184/233）的菌株具有三唑类耐药性（伊曲康唑或伏立康唑）,33.48%（78/233）的菌株具有交叉抗性（伊曲康唑和伏立康唑）,33株在启动子区域发生了碱基串联重复插入,包括4种类型TR34/L98H（n=25）,TR34/L98H/S297T/F495I（n=3）,TR46/Y121F/T289A（n=3）和TR53（n=2）。73株烟曲霉的cyp51A基因在CDS（Coding DNA Sequence,基因编码序列）水平产生不同程度的变异,在适应环境的过程中,该基因受到较强的正选择作用（ω=2.0004＞1）;含有4个同义突变位点和11个非同义突变位点,系统发育分析表明cyp51A基因中非同义突变位点和同义突变位点各自独立进化;在4个同义突变位点中,位点（267G＞A和540G＞A）,位点（540G＞A和1074A＞G）之间有发生重组的证据。而在15个地州样本和三江并流区样本中,三唑类耐药性菌株发生频率分别为15.89%和6.95%,具有交叉抗性菌株发生率为5.75%和3.02%,cyp51A基因的突变频率也大幅降低。晋宁蔬菜大棚烟曲霉耐药性（78.97%）是迄今为止报道的最高的耐药性菌株发生频率,可能与蔬菜大棚高频率使用三唑类杀菌剂有关;云南境内环境样品中,TR34/L98H是主要的突变类型,首次在亚洲报道环境中发现TR53突变。2.云南省境内的烟曲霉群体存在高水平的遗传多样性。在昆明晋宁蔬菜大棚、云南地州和三江并流烟曲霉群体中,发现大量新的等位基因和基因型,共享基因型分别仅占2.9%,6.1%和1.2%。群体结构分析显示,晋宁蔬菜大棚、云南地州和三江并流区烟曲霉都仅含有两个遗传群体,虽然各地理群体内部都存在基因流,但在群体结构特征上存在一定的差异,均存在显著的遗传分化,主要的遗传变异都来自群体内的个体之间,分别为98%,96%和96%。除大理南涧和曲靖沾益外,绝大多数的采样点中,均发现了重组的证据。重组和基因交流可能是云南境内烟曲霉遗传多样性水平高的主要原因。3.三江并流区存在地理隔离。Mantel测试结果显示金沙江沿江烟曲霉群体和怒江沿江烟曲霉群体之间Nei P遗传距离与地理距离存在极显著的正相关性,遗传分化与地理距离也存在显著的正相关性;主坐标分析（Po CA）和主成分判别分析（DAPC）结果显示,金沙江烟曲霉的6个群体和怒江烟曲霉的6个群体极间存在明显的遗传差异,菌株聚类在不同的区域,金沙江烟曲霉群体和怒江的烟曲霉群体存在地理隔离,金沙江和怒江之间的云岭和碧罗雪山可能是阻碍两个地理群体间基因交流的主要地理障碍,而高海拔环境对三江并流区烟曲霉群体间的基因流动具有限制作用。4.云南境内的烟曲霉与全球其他地理群体存在较大的遗传差异和独立进化。昆明晋宁蔬菜大棚、云南地州和三江并流区的烟曲霉群体与全球其他11个地理群体都存在极显著的遗传分化,种群结构特征存在差异,云南境内的种群具有较强的基因交流。与云南群体遗传分化最大的地理群体来自非洲,最小的地理群体是东亚群体。进化分析显示,云南境内的烟曲霉样本形成多个单起源的支系,具有独特的地理特征,耐药性基因型TR34/L98H独立进化。本文的创新点体现在:1.在云南省境内的设施农业如蔬菜温室内土壤中,发现迄今为止最高的烟曲霉耐药菌株发生频率,其中大部分个体存在显著的对三唑类农药和临床药品的交叉耐受。2.发现耐药菌株的TR34/L98H是cyp51A基因在云南样本中的主要的突变类型,首次在亚洲环境中发现TR53突变。进化分析显示在适应农药土壤环境的过程中,该基因受到较强的正选择作用,耐药基因型在自然群体中经历了多次独立进化,三唑类农药环境的选择在该基因的突变产生和维持方面起着重要的作用。3.发现大量新的微卫星等位基因和基因型,存在高水平的遗传多样性,云南样本与全球样本存在较大的遗传变异;发现广泛的基因流、群体间低频发生的共享基因型、显著的遗传差异以及重组是云南样本群体遗传结构构成的主因,也是耐药性菌株传播扩散的主要途径,高山河流如金沙江和怒江之间的云岭和碧罗雪山能够成为地理群体间基因交流的主要障碍,而高海拔环境对三江并流区烟曲霉群体间的基因流动具有限制作用。该研究将有助于全面了解云南省境内环境中烟曲霉的遗传多样性、三唑类耐药性状况和药物作用靶标基因cyp51A的遗传变异模式等科学问题,为今后科学、系统评价农业生产上三唑类杀菌剂的使用对病原菌的耐药性产生的影响机理研究奠定基础。