虹鳟（Oncorhynchus mykiss）是一种典型的冷水性鱼类,其适宜生长水温是12-18℃,当水温超过25℃虹鳟会逐渐死亡,因此,在我国大部分地区,夏季高温成为了虹鳟减产和死亡的最大威胁。由mi RNA介导的靶基因m RNA的调控,可能是应答热刺激、增强适应性的主要策略,近年来mi RNA在机体生长、发育以及应激等过程中发挥重要的调控作用已成为热点。本研究基于前期转录组数据分析发现mi R-8159-x在热应激和非热应激下差异表达,推测mi R-8159-x可能在虹鳟热应激过程中具有调控作用,但作用过程尚不清楚。因此,为了探究mi RNA参与虹鳟热应激的调控机制,本研究分离虹鳟肝细胞并进行了原代培养,构建hsp90a1野生型和突变型重组载体,合成mi R-8159-x模拟物和抑制物。通过双荧光素酶报告系统验证靶向关系,RT-q PCR、5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（Ed U）标记技术及流式细胞术验证了mi R-8159-x在虹鳟肝细胞中具有调控作用,并且在热应激（24℃）条件下通过RT-q PCR和蛋白质免疫印迹（Western Blot）方法验证了mi R-8159-x参与虹鳟肝细胞热应激调控的分子机制。具体研究内容如下:1.以虹鳟肝脏组织为材料,用胰酶消化法成功分离虹鳟肝细胞并进行了原代培养。细胞生长状态良好,已经传至20余代。该细胞系最适培养基是DMEM培养基;最适生长温度是18℃,最适血清浓度为15%。2.基于mi Randa和本课题组前期转录组数据中靶标关系的预测,筛选了靶基因hsp90a1。构建了用于检测mi RNA靶标关系的的野生型和突变型双荧光素重组载体。双荧光素酶报告结果显示:在转染野生型重组载体的试验中,与对照组相比,mi R-8159-x过表达组荧光素酶活性下调且差异极显著（**P<0.01）;转染突变型重组载体质粒的试验中,与对照组相比,mi R-8159-x过表达组差异不显著。该结果说明mi R-8159-x与hsp90a1存在靶向关系。3.将mi R-8159-x模拟物、mi R-8159-x抑制物、mi R-8159-x阴性对照分别转染至虹鳟肝细胞,RT-q PCR检测hsp90a1基因表达量,结果显示:与对照组相比,mi R-8159-x过表达组hsp90a1表达水平显著降低48.05%（P<0.05）;mi R-8159-x抑制组hsp90a1表达水平升高1.17倍（P>0.05）,说明mi R-8159-x对hsp90a1具有负调控作用;Ed U检测细胞增殖情况,结果表明:mi R-8159-x过表达后增殖的阳性细胞信号较弱,同样mi R-8159-x被抑制后增殖的阳性细胞信号也很弱,此结果说明mi R-8159-x对细胞的增殖无显著影响;流式细胞术检测细胞凋亡,结果显示:当mi R-8159-x过表达时,虹鳟肝细胞的凋亡率由9.75%升高至12.24%（P<0.05）,而当mi R-8159-x被抑制时,虹鳟肝细胞的凋亡率由9.75%降低至7.42%（P<0.05）,此结果说明mi R-8159-x对虹鳟肝细胞凋亡具有促进作用。以上研究表明mi R-8159-x对虹鳟肝细胞增殖无影响,对细胞凋亡具有促进作用。4.为了进一步了解mi R-8159-x对热应激的调控机制,对细胞进行了热处理（24℃）,热处理4 h、8 h、12 h、24 h及48 h后,RT-q PCR检测细胞中hsp90a1m RNA相对表达量,结果显示:在热应激4 h时,与对照组相比,mi R-8159-x过表达组hsp90a1 m RNA水平显著降低20.2%（P<0.05）,mi R-8159-x被抑制组hsp90a1 m RNA水平升高1.31倍（P>0.05）,此结果说明在热应激状态下mi R-8159-x对hsp90a1基因具有负调控作用;Western Blot检测结果显示:在热应激12 h时,与对照组相比,mi R-8159-x过表达组蛋白水平显著降低36.5%（P<0.05）,被抑制组蛋白水平升高1.08倍（P>0.05）,此结果说明mi R-8159-x对Hsp90a1蛋白的表达也具有负调控作用,但滞后于基因表达。此项研究表明mi R-8159-x通过负调控hsp90a1参与虹鳟热应激调控机理。