论文部分内容阅读
香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)侵染引起的维管束系统性病害，严重威胁世界香蕉产业的发展。依据病原菌在不同类型香蕉品系或者不同属种的致病程度可将其划分为4个生理小种，其中4号生理小种(FOC4)的毁灭性最大。多聚半乳糖醛酸酶(PG)是植物病原真菌侵染植物时分泌的降解植物果胶骨架结构的主要酶之一，是一种重要的致病因子。多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)能够特异性的结合并抑制真菌的多聚半乳糖醛酸酶(PG)的活性，与植物的抗病性有着密切的联系。 本研究选取不同细胞基因型的香蕉品种：农科1号(Musa AAA)、东莞大蕉(MusaABB)、粉杂1号(Musa ABB)、海贡(Musa AA)和金手指(Musa AAAB)等现阶段生产中的几种含不同基因型，对香蕉枯萎病具有一定抗病性的品种为植物材料，研究其体内PGIP对FOC4分泌的PGs的抑制活性，以期确定对FOC4 PGs具有最高抑制活性的品种，为进一步探讨香蕉体内的PGIP及其与FOC4 PGs的相互作用，提供实验材料和研究基础。 将在PDA培养基上培养7d的FOC4菌落用打孔器在边缘打下菌饼，放入装有果胶诱导培养基的三角瓶中，28℃培养箱中静置培养7d，将获得的培养液用双层纱布过滤后，经离心，超滤浓缩，硫酸铵沉淀(饱和度为60％)，透析等过程制备FOC4 PGs，作为香蕉体内PGIP的作用靶标。植物组织经过破碎过滤离心和超滤浓缩等过程之后，制备得到植物的PGIP粗提液。采用的2-氰乙酰胺法分别测定PG和PGIP的活性。 测定结果表明，实验用的几种香蕉对FOC4 PGs均有不同程度的抑制活性，但不同香蕉品种的PGIP对FOC4 PGs的抑制活性存在差异，东莞大蕉PGIP的活性最高，对FOC4 PGs的抑制活性达4281.735U；其次是农科1号，抑制活性为3137.285U；粉杂1号和金手指PGIP活性分别为2714.336U和2152.356U，在这些品种中，海贡的抑制活性最低，为1591.839U。 植物不同组织器官的PGIP含量不同，本研究发现，在东莞大蕉的根、假茎和叶组织中，以假茎组织的PGIP的含量和活性最高。 通过FOC4接种试验发现，接种病原物能显著提高东莞大蕉组织中的PGIP含量，说明病原菌的侵染作用能诱导植物产生PGIP，这一试验结果，对进一步研究蕉类植物PGIP的功能，有一定的借鉴。本试验还发现东莞大蕉幼苗初期PGIP的活性明显高于幼苗后期。 选取培养63d，用FOC4处理的东莞大蕉假茎为试验材料，将提取的蛋白粗提液进行初步纯化，经过硫酸铵沉淀、超滤浓缩、ConA-sepharose4B亲和柱层析、CM-sepharose Fast Flow弱阳离子柱层析后，收集活性峰，将蛋白液超滤浓缩，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示达到了初步纯化的目的。酸碱度和温度对PGIP的活性都有影响，通过温度15℃-90℃和pH2-10条件下PGIP对FOC4 PGs的抑制试验，表明，东莞大蕉PGIP在温度为30℃和pH=6时，活性最强。 本实验选取的试验材料类型多样，基本上覆盖了香蕉的大部分基因类型。通过对不同香蕉品种、不同器官、不同处理PGIP抑制活性的比较，找到活性最高的PGIP进行纯化。然后探索其热稳定性，酸碱稳定性，了解它的蛋白特性，为香蕉抗枯萎病的抗病育种提供重要的理论依据和实践材料。