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肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）约占原发性肝癌的90%以上,是最常见类型的原发性肝癌（primary hepatic carcinoma）,HCC是全球范围内第五大癌症,且为全球致死率第三大癌症。肝癌的预后较差,而且有很高的复发风险,对HCC早期诊断显得尤为重要。甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）作为HCC早期诊断的标记物已被普遍使用多年,但AFP诊断肝癌的敏感性仅为60%70%,它的临床诊断价值极其有限。近年来诸多研究表明可溶性程序性死亡因子配体1（sPD-L1）在肝细胞癌患者的血清中较健康人血清呈现显著性差异,预示着sPD-L1可以作为HCC临床诊断的辅助性血清标志物。大量研究证实肝癌标志物联合检测可显著提高敏感性和诊断的准确性。目前血清标志物检测方法主要包括酶联免疫吸附技术（ELISA）、免疫胶体金技术、蛋白质芯片法、化学发光免疫分析法等。其中ELISA法实验步骤繁琐,耗时耗力,结果易受外部因素影响。免疫胶体金技术检测灵敏度不高,只能定性,不能定量,蛋白质芯片法对实验室设备要求较高,且仪器设备价格昂贵。化学发光免疫分析法消耗样本少、操作简便、且检测结果较为准确,但需要患者承担高昂的检测费用。因此探索高效、特异、准确、低成本的检测技术对于肝癌的快速诊断具有十分重要的意义。目前肝癌标志物的血清学检测主要依赖于抗原抗体反应,但国内的肝癌血清标志物抗体产品质量参差不齐,进口产品价格较昂贵。制备高效价、特异性强、低成本的肝癌血清标志物抗体可为肝癌的早期快速诊断提供有效的试剂。极大角度光纤光栅（excessively tilted fiber grating,Ex-TFG）生物传感器具有检测灵敏度高、特异性好、无需标记、成本低、可实现实时检测的优点。前期本实验室已成功将Ex-TFG生物传感器运用于心力衰竭生物标记物N末端脑钠肽前体（NT-proBNP）、猪圆环病毒2型（PCV2）、新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）和降钙素原（PCT）的检测,将抗原抗体反应的特异性与光纤光栅传感器检测的敏感性结合,在检测的灵敏度上取得了突破,并发表了高水平研究论文。本文通过对前期研制的Ex-TFG生物传感器进一步进行改进,以提高其检测灵敏度、稳定性和特异性。本文通过原核表达系统制备血清标志物蛋白AFP、sPD-L1,将sPD-L1采用长程免疫法免疫BALB/c小鼠,利用聚乙二醇（PEG）细胞融合技术制备抗sPD-L1单克隆抗体,为HCC的早期快速诊断提供有效试剂。对Ex-TFG进行羟基化、硅烷化修饰后,在光栅表面涂覆金纳米壳（AuNS）与氧化石墨烯（GO）。并活化GO表面的羧基（-COOH）。使其与抗体通过-NH-CO-共价键结合。利用脱脂奶粉对光栅表面空余位点进行封闭,进行不同浓度抗原的检测,并对传感器的重复性,特异性,临床样本检测等进行验证。从而初步建立起一种基于Ex-TFG生物传感器的血清标志物快速检测技术,为肝癌的快速诊断提供新的检测手段。本文的研究内容如下:（1）根据GenBank发布的人源PD-L1基因序列（GenBank登录号:AY254342.1）,AFP基因序列（GenBank登录号:NM001134.2）分别对序列分析后进行大肠杆菌密码子偏好性优化,使其适合于大肠杆菌表达系统。化学合成法分别合成全长目的基因sPD-L1、AFP。并将其分别连接至质粒载体pET28a（+）。从而构建重组质粒sPD-L1-pET28a（+）、AFP-pET28a（+）。将重组质粒分别转化至大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）进行诱导表达,并对诱导表达条件进行优化。利用镍柱对目的蛋白进行亲和层析,利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、二喹啉甲酸（BCA）法、蛋白免疫印迹（Western blot）对纯化所得的重组蛋白sPD-L1、AFP进行纯度、浓度、特异性鉴定。（2）将上述制备所得的重组蛋白sPD-L1与佐剂进行乳化,作为免疫原对BALB/c小鼠进行长程免疫。取4次免疫后的小鼠脾脏制成脾细胞悬液,与SP/20细胞混合,采用PEG法进行细胞融合。采用间接ELISA法,对融合细胞及亚克隆后的细胞进行两轮以上筛选。将筛选得到的单克隆阳性细胞株进行扩大培养,注射入BALB/c小鼠腹腔从而制备腹水型单克隆抗体。对单克隆细胞株进行抗体亚型鉴定,利用Protein A柱对腹水型单抗进行纯化,利用SDS-PAGE、二喹啉甲酸（BCA）法、蛋白免疫印迹（Western blot）和酶联免疫吸附测定（ELISA）对纯化所得的腹水型单抗进行鉴定。（3）利用5%的HNO3、无水乙醇、离子水（RO）对光栅进行洁净化处理,取浓度为0.2M的NaOH溶液对光栅表面进行浸泡,使其表面富含大量的羟基（-OH）,从而实现羟基化。将羟基化的栅区表面浸没于适量的1%3-巯丙基三甲氧基（MPTMS）溶液使光栅表面带上巯基（-SH）从而实现硅烷化。将离心处理后的金纳米壳（AuNS）涂覆光栅表面过夜。金纳米壳氨基化后取200uL氧化石墨烯（GO）分散液浸泡栅区隔夜。利用1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化GO表面的羧基（-COOH）。分别修饰sPD-L1单克隆抗体以及AFP单克隆抗体,利用5%脱脂奶粉对光栅进行封闭处理,分别检测不同浓度的sPD-L1、AFP抗原,并对生物传感器的灵敏度、特异性、重复性等进行评价,再对临床血清样本进行测试分析。结果:（1）重组质粒pET28a（+）-sPD-L1、pET28a（+）-AFP经过酶切鉴定后,分别在668bp、1875bp处有明显的特异性条带出现,且测序结果与已知对应序列一致,说明重组质粒构建成功。重组菌株pET28a（+）-sPD-L1/BL21（DE3）在37℃,0.5mmol/L IPTG,9h的诱导条件下,目的蛋白sPD-L1的表达量最高;经过SDS-PAGE鉴定显示,重组蛋白sPD-L1、AFP的沉淀表达量均高于上清表达量。经过镍柱亲和层析后的目的蛋白sPD-L1、AFP纯度均能达到90%以上且浓度分别能够达到945.7ug/mL以及191.1ug/mL,经过Western blot鉴定显示,目的蛋白sPD-L1、AFP能够分别与相应的市售单克隆抗体发生良好的结合,且于28KD以及75KD左右有特异性条带出现。（2）细胞融合实验显示,细胞融合率为86.7%,阳性率为80.4%,经过两轮亚克隆筛选共获得4株单克隆细胞株,分别命名为1-3H,2-2G,2-9G,1-10C。单抗亚型鉴定结果表明1-10C、2-2G为IgG2b型、2-9G为IgG2a型。SDS-PAGE鉴定显示纯化后的腹水型单抗于50KD、25KD位置出现条带,与IgG型抗体重链、轻链条带相符。经过BCA法浓度测定,纯化后的腹水单抗浓度较高,达到2.064mg/mL。ELISA鉴定结果显示2-2G、2-9G腹水单抗效价均能够达到1:2048000以上。4株杂交瘤细胞株经反复冻存、复苏及多次传代,均能分泌高效价抗体,经Western blot鉴定后证实所获得单抗是特异性针对sPD-L1抗原。（3）极大角度光纤光栅经过光纤表面羟基化、硅烷化、涂覆金纳米壳、氨基化、涂覆氧化石墨烯、活化羧基、修饰sPD-L1抗体、封闭后进行测试分析,结果显示其各步骤的波长红移量为:0.235nm、0.255nm、0.866nm、0.006nm、0.64nm、0.076nm、0.3nm、0.04nm。表明各步骤修饰均较为理想。该生物传感器对sPD-L1抗原的检测下限为1pg/mL。检测范围为1pg/mL10ng/mL。对极大角度光纤光栅表面经过上述羟基化至活化羧基修饰过程最后修饰AFP抗体、封闭后进行测试分析,结果显示其各步骤的波长红移量为0.225nm、0.047nm、0.832nm、0.736nm、1.152nm、1.168nm、1.408nm、1.68nm,修饰结果较为理想,检测范围为5 pg/mL10ng/mL。经过特异性实验显示,其与不同浓度的布鲁氏菌病血清学标志物BP26蛋白均不发生特异性反应,表明此传感器特异性良好。利用研制的免疫传感器分别对肝癌患者和健康人血清中的AFP、sPD-L1进行检测,结果显示肝癌患者血清和健康人血清的谐振波长偏移量在两种标志物的检测中均存在显著性差异,并在同一患者中AFP和sPD-L1检测结果呈现一定的正相关性,表明该传感器对AFP、sPD-L1检测具有高度的特异性,可满足临床检测要求。结论:本研究构建了sPD-L1、AFP基因工程菌,并成功实现了在原核表达系统中高效表达sPD-L1、AFP蛋白。通过长程免疫法进行抗原免疫、PEG法细胞融合、有限稀释法亚克隆筛选后得到了4株能稳定分泌抗sPD-L1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,利用制备的抗原、抗体,初步建立了基于极大角度光纤光栅生物传感器的AFP、sPD-L1快速检测方法,并对传感器的灵敏度、重复性,特异性以及临床应用等进行了测试,该方法具有较高的灵敏度、特异性强、可重复性较好等优点,可用于血清样品中的AFP、sPD-L1检测,为肝癌的诊断提供了新的检测技术和手段。