研究背景先天性脊柱侧凸(Congenital scoliosis,CS)是胚胎期脊椎发育异常而引起的脊柱侧凸,可在脊柱冠状面、矢状面和水平面引起侧凸、后凸和旋转畸形。在脊柱发育的胚胎期,形成一种重要的过渡性组织-体节(somite),体节决定中轴骨的形成,已经证明体节发育受影响可导致脊椎畸形,包括脊椎形成障碍和脊椎分节不良。脊椎畸形目前确切的病因尚不清楚,动物实验表明发育相关基因的表达异常可导致脊椎畸形,而射线、药物或中毒也可诱导脊椎畸形。近年来,基因突变鼠和基因敲除鼠被广泛应用于基因在发育过程中功能作用的研究,人们逐渐了解了单一基因功能障碍可导致的发育异常。大量的动物实验均显示了多种基因在体节发育中起到重要作用,若其表达异常,则可导致明显的脊椎畸形,因此目前CS的遗传病学研究引起了越来越多学者的重视。目前的研究支持CS是一种多基因遗传病,不同的基因异常可导致不同的表型。目前对于人类CS候选基因的研究尚处于初始的阶段,在国内尚是空白。近20年来对小鼠和鸡胚胎发育的研究使我们对脊椎发育的分子胚胎学信息有了越来越多的了解。对于物种进化而言,不同物种间在核苷酸序列和氨基酸序列上有较高的保守性。我们可以通过系统回顾小鼠基因组数据库就可以找到那些与脊椎畸形相关的基因,再通过基因图的位置以同线性保守基因序列为基础进一步确立人类CS可能的候选基因。研究目的●通过对10个候选基因SNPs的筛查,探索候选基因与人类CS之间的关联,依据实验结果提出可能的病因学假说●通过对候选基因SNPs基因型与CS临床表型的关联分析,探索可能的致病基因,从遗传学角度解释CS临床表型●从基因水平探索候选基因与CS及CS临床表型之间的关系研究方法本研究采用病例-对照研究设计。●研究对象:根据入选和排除标准入选2005年10月-2008年5月期间在北京协和医院脊柱中心收治且确诊的154例中国汉族先天性脊柱侧凸(Cs)患者和144例非先天性脊柱侧凸的对照组。●研究方法:(?) QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取全血DNA(?)在NCBI-SNPs数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)中查找上述10个基因中已知的SNPs。优先选取杂合度高于10%,位于外显子或有错义突变的SNPs和位于3’-和5’-调控区的SNPs作为遗传标志,共选取了75个SNPs。(?)将病例组根据脊椎畸形临床特点、脊椎畸形部位、是否合并肋骨畸形将病例组进行分层。(?)所有研究对象应用VeraCode GoldenGate Genotyping Assay对所选的SNPs进行基因型鉴定。(?)拟和优度x~2检验(Goodness-of-fit Chi-square test)分析病例、对照组基因型频率的分布是否符合H-W平衡。(?)对单个位点行基于基因型/等位基因频率的关联分析和基于基因型频率的Logistic回归分析,评估单个位点与CS发病风险的相关性。(?)应用Haploview和在线软件SNPstats对单个基因内的多个位点进行连锁不平衡分析、单倍型关联分析以及非条件Logistic回归分析,评估单倍型与CS发生风险的相关性。研究结果●我们共检测了10个基因的75个位点,最终有11个位点被放弃,其中8个位点是因为检出率较低,无法进行进一步的分析,另外3个位点是由于检测结果显示该位点无多态性而放弃,其余65个位点检出率均＞99.3%。●对照组中有2个基因共4个SNP位点的H-W平衡检验时P值＜0.05,不符合H-W平衡,它们是DLL3-rs2304222,MYLK-rs1254392,MYLK-rs820463,MYLK-rs9422。病例组中有3个基因共7个SNP位点的P值＜0.05,不符合H-W平衡,它们是LMX1A-rs12029324,LMX1A-rs12023709,LMX1A-rs1819768,LMX1A-rs16841013,MYLK-rs9422,TBX6-rs3809624。●DLL3、DVL2、HES7、LMX1A、MYLK、TBX6、WNT3A等7个基因内的位点之间有连锁不平衡关系。DLL3有四个位点(rs2304223、rs1110627、rs2304214和rs3212276)存在连锁不平衡关系,组成连锁不平衡block。DVL2的rs2074222、rs222837、rs222836、rs2074216四个位点组成连锁不平衡block。HES7的rs1442849和rs1348325两个位点组成连锁不平衡block。LMX1A内发现了有三个连锁不平衡block,分别是rs1819768、rs12023709、rs16840972、rs16841013四个位点组成的block 1,rs6671290、rs16841029和rs1354510三个位点组成的block 2,rs4657412、rs6667188、rs1532815三个位点组成的block 3。MYLK的rs12172926、rs3732487、rs1350152三个位点组成连锁不平衡block。TBX6的rs8060511和rs3809624两个位点组成连锁不平衡block。WNT3A内发现有两个连锁不平衡block,分别是rs708114、rs6426490、rs6672559、rs3094913、rs881398、rs708121、rs3094911、rs3094912、rs708122、rs10916258十个位点组成的block 1,rs7539664、rs10916262、rs11589513、rs6675092、rs4653533五个位点组成的block 2。●共筛选了DLL3的5个SNP位点:rs2304222,rs2304214,rs2304223,rs3212276,rs1110627。在对病例组和对照组行基于等位基因和基因型的单个位点关联分析中我们并没有得到与这5个位点相关的阳性结果;在对单个位点的Logistic回归分析中也未发现阳性位点;对DLL3中多个位点进行单倍型关联分析和Logistic回归分析,均未发现阳性结果。在对病例组的临床表型的进一步分层分析中也没有发现阳性结果。这说明这5个位点的遗传多态性和CS易感性无关,对中国汉族人群来说,DLL3基因的遗传变异可能不是引起CS发病的主要因素。●共筛选了DVL2的5个SNP位点:rs222850,rs222837,rs222836,rs2074216,rs2074222。在对病例组和对照组行基于等位基因和基因型的单个位点关联分析中我们并没有得到与这5个位点相关的阳性结果;在对单个位点的Logistic回归分析中也未发现阳性位点;对DVL2中多个位点进行单倍型关联分析和Logistic回归分析,均未发现阳性结果。在对病例组的临床表型的进一步分层分析中也没有发现阳性结果,这说明这5个位点的遗传多态性和CS易感性无关,对中国汉族人群来说,DVL2基因的遗传变异可能不是引起CS发病的主要因素。●共筛选了HES7的3个SNP位点:rs1442849,rs3027279,rs1348325。在对病例组和对照组行基于等位基因和基因型的单个位点关联分析中我们并没有得到与这3个位点相关的阳性结果;在对单个位点的Logistic回归分析中也未发现阳性位点;对HES7中多个位点进行单倍型关联分析发现,HEST-rs1442849和HES7-rs1348325所组成的连锁不平衡块中,ht2-GA在两组中存在显著性差异(x~2=3.876,P=0.049);但是在进一步的单倍型Logistic回归分析中未发现阳性结果。在对病例组的临床表型的进一步分层分析中发现,HES7-rs1442849和HES7-rs3027279两个位点在有分节障碍的CS组和对照组间比较时,等位基因在两组间存在显著性差异(x~2=4.472,P=0.035;x~2=4.786,P=0.029);但在基因型关联分析中这两组间无阳性结果发现;对这两组行单个位点Logistic回归分析未见阳性结果;在进一步的单倍型关联分析和Logistic回归分析中也无阳性结果发现。在对胸椎畸形的CS组和对照组进行比较时发现,HES7-rs1442849和HES7-rs3027279两个位点的等位基因在两组间存在显著性差异(x~2=4.211,P=0.040;x~2=4.781,P=0.029);HES7-rs3027279位点的基因型在两组间也存在显著性差异(x~2=5.979,P=0.049);在对单个位点Logistic回归分析时发现HES7-rs1442849位点的A/G-A/A相对于G/G来说是风险因素(OR=1.74,95%CI=1.05-2.86,P=0.029);在对HES7-rs1442849和HES7-rs3027279两个位点组成的连锁不平衡块行关联分析时发现,htl-AA和ht2-GA在两组中均存在显著性差异(x~2=4.211,p=0.0402;x~2=5.242,P=0.022)。这些结果提示HES7基因对于有分节障碍和有胸椎畸形的先天性脊柱侧凸发病来说是易感基因。●共筛选了LMX1A的13个SNP位点:rs4657412,rs12029324,rs12023709,rs12040140,rs6667188,rs1532815,rs1819768,rs6671290,rs16841029,rs4656435,rs1354510,rs16841013,rs16840972。在对病例组和对照组行基于等位基因和基因型的单个位点关联分析中我们并没有得到与这15个位点相关的阳性结果;在对单个位点行Logistic回归分析发现,LMX1A-rs1354510的A/G相对于G/G-A/A为保护性因素(OR=0.58,95%CI=0.37-0.92,P=0.02),LMX1A-rs16841013的A/G相对于G/G-A/A为保护性因素(OR=0.57,95%CI=0.36-0.91,P=0.018);在对多位点组成的单倍型行关联分析和Logistic回归分析时未发现阳性结果。在对病例组的临床表型的进一步分层分析中发现,在对有形成障碍的CS组和对照组两组进行比较时,有三个位点的基因型在两组间存在显著性差异,这三个位点分别是LMX1A-rs6671290(x~2=7.839,P=0.019),LMX1A-rs1354510(x~2=10.015,P=0.007),LMX1A-rs16841013(x~2=10.350,P=0.006);进一步对这两组行单个位点Logistic回归分析发现,LMX1A-rs4657412的A/G相对于G/G-A/A为保护性因素(OR=0.57,95%CI=0.33-0.96,P=0.035),LMX1A-rs6671290的A/G相对于G/G为保护性因素(OR=0.66,95%CI=0.37-1.18,P=0.025),而A/A为危险性因素(OR=2.10,95%CI=0.81-5.41,P=0.025),LMX1A-rs1354510的A/G相对于G/G-A/A为保护性因素(OR=0.42,95%CI=0.25-0.73,P=0.0017),LMX1A-rs16841013的A/G相对于G/G-A/A,为保护性因素(R=0.42,95%CI=0.24-0.73,P=0.0016);在对多位点组成的单倍型行关联分析和Logistic回归分析时无阳性发现。在对有肋骨畸形的CS组和对照组进行分析时发现,单个位点Logistic回归分析示LMX1A-rs1354510的A/G相对于A/A-G/G为保护性因素(OR=0.53,95%CI=0.30-0.93,P=0.025),LMX1A-rs16841013的A/G相对于G/G-A/A为保护性因素(OR=0.52,95%CI=0.30-0.93,P=0.022);而对多位点组成的单倍型行关联分析和Logistic回归分析时无阳性发现。以上结果说明,LMX1A可能是有形成障碍的先天性脊柱侧凸和有肋骨畸形的先天性脊柱侧凸的易感基因。●共筛选了MYLK的8个SNP位点:rs1254392,rs3732487,rs40305,rs1350152,rs820463,rs9422,rs13080634,rs12172926。在对病例组和对照组行基于等位基因和基因型的单个位点关联分析中我们并没有得到与这8个位点相关的阳性结果;在对单个位点的Logistic回归分析中也未发现阳性位点;对MYLK中多个位点进行单倍型关联分析和Logistic回归分析,均未发现阳性结果。在对病例组的临床表型的进一步分层分析中发现,在对腰椎畸形的CS组和对照组进行比较时,两个位点的基因型在两组间存在显著性差异,这两个位点是MYLK-rs13080634(x~2=80.073,P=0.000),MYLK-rs12172926(x~2=12.178,P=0.000);对这两组行单个位点Logistic回归分析示MYLK-rs3732487的A/C相对于A/A-C/C,为保护性因素(OR=0.47,95%CI=0.23-0.96,P=0.035);在对多位点单倍型的关联分析和Logistic回归分析时无阳性结果。这说明MYLK基因可能是腰椎畸形的先天性侧凸发病的易感基因。●共筛选了NOTCH1的5个SNP位点:rs2229971,rs10521,rs2229974,rs6563,rs4489420。在对病例组和对照组行基于等位基因和基因型的单个位点关联分析中我们并没有得到与这5个位点相关的阳性结果,对单个位点Logistic回归分析、多位点单倍型关联分析和Logistic回归分析时也无阳性结果。在对病例组的临床表型的进一步分层分析中也没有发现阳性结果,这说明这5个位点的遗传多态性和CS易感性无关,对中国汉族人群来说,NOTCH1基因的遗传变异可能不是引起CS发病的主要因素。●共筛选了PAX1的3个SNP位点:rs17861031,rs6047590,rs6035934。在对病例组和对照组行基于等位基因和基因型的单个位点关联分析中我们并没有得到与这3个位点相关的阳性结果,对单个位点Logistic回归分析、多位点单倍型关联分析和Logistic回归分析时也无阳性结果。在对病例组的临床表型的进一步分层分析中也没有发现阳性结果,这说明这3个位点的遗传多态性和CS易感性无关,对中国汉族人群来说,PAX1基因的遗传变异可能不是引起CS发病的主要因素●共筛选了SIM2的3个SNP位点:rs2073416,rs2051397,rs2073601。在对病例组和对照组行基于等位基因和基因型的单个位点关联分析中我们并没有得到与这3个位点相关的阳性结果,对单个位点Logistic回归分析、多位点单倍型关联分析和Logistie回归分析时也无阳性结果。在对病例组的临床表型的进一步分层分析中也没有发现阳性结果,这说明这3个位点的遗传多态性和CS易感性无关,对中国汉族人群来说,SIM2基因的遗传变异可能不是引起CS发病的主要因素。●筛选了TBX6基因的2个SNP位点:rs8060511和rs3809624。在对病例组和对照组行基于等位基因和基因型的单个位点关联分析中发现,TBX6-rs3809624位点的三种基因型构成在病例组和对照组间存在显著性差异(x~2=6.836,P=0.033);进一步的单个位点Logistic回归分析可以看出相对于TBX6-rs3809624的G/G基因型,A/G-A/A为危险性因素(OR=1.89,95%CI=1.14-3.11,P=0.012);在对多位点单倍型行关联分析和Logistic回归分析没有发现阳性结果。在对病例组的临床表型的进一步分层分析中,我们发现在对有分节障碍的CS组和对照组进行比较分析时,TBX6-rs3809624的基因型在两组间存在显著性差异(x~2=7.780,P=0.020);对这两组的单个位点行Logistic回归分析时发现,TBX6-rs8060511的A/C相对于C/C-A/A为危险性因素(OR=1.74,95%CI=1.06-2.87,P=0.029),TBX6-rs3809624的A/G-A/A相对于G/G为危险性因素(OR=2.03,95%CI=1.20-3.43,P=0.008);而在对多位点单倍型关联分析和Logistic回归分析时未发现阳性结果。在对无肋骨畸形的CS组和对照组进行分析时发现,TBX6-rs3809624的基因型在两组间存在显著性差异(x~2=8.263,P=0.016),行单个位点Logistic回归分析示TBX6-rs3809624的A/G-A/A相对于G/G为危险性因素(OR=2.25,95%CI=1.25-4.08,P=0.0072);进一步行多位点单倍型关联分析发现TBX6内的Block中的htl-CG在两组间有显著性差异(x~2=7.379,P=0.007)。在对有肋骨畸形的CS组和对照组进行单个位点Logistic回归分析时发现,TBX6-rs3809624的A/G相对于G/G-A/A,为危险性因素(OR=1.80,95%CI=1.02-3.18,P=0.041)。在对有胸椎畸形的CS组和对照组进行比较时发现,TBX6-rs3809624位点的基因型在两组间存在显著性差异(x~2=6.642,P=0.036);对这两组行单个位点Logistic回归分析示TBX6-rs3809624的A/G-A/A相对于G/G,为危险性因素(OR=1.88,95%CI=1.12-3.14,P=0.015);在对多位点单倍型行关联分析和Logistic回归分析时未发现阳性结果。以上实验结果提示TBX6基因是中国汉族人群先天性脊柱侧凸的易感基因,进一步的分析说明TBX6基因对有分节障碍的先天性脊柱侧凸、无肋骨畸形的先天性脊柱侧凸、有肋骨畸形的先天性脊柱侧凸以及有胸椎畸形的先天性脊柱侧凸均有关联。●共筛选了WNT3A基因中的17个SNP位点。在对病例组和对照组行基于等位基因和基因型的单个位点关联分析中我们并没有得到与这17个位点相关的阳性结果;对单个位点Logistic回归分析时发现,WNT3A-rs6672559的A/A相对于G/G-A/G为保护性因素(OR=0.43,95%CI=0.20-0.90,P=0.021);对多位点单倍型关联分析和Logistic回归分析时未发现阳性结果。在对病例组的临床表型的进一步分层分析中发现,在对有分节障碍的CS组和对照组进行比较分析时发现,WNT3A-rs6672559位点的基因型在两组间存在显著性差异(x~2=6.104,P=0.047);单个位点Logistic回归分析示WNT3A-rs6672559的A/A相对于G/G-A/G为保护性因素(OR=0.40,95%CI=0.18-0.86,P=0.016)。在对无肋骨畸形的CS组和对照组的分析中发现,WNT3A-rs6675092和WNT3A-rs6672559位点的基因型在两组间存在显著性差异(x~2=5.374,P=0.048;x~2=6.900,P=0.032);单个位点Logistic回归分析示WNT3A-rs6672559的A/A相对于G/G-A/G为保护性因素(OR=0.35,95%CI=0.15-0.83,P=0.016)。在对有肋骨畸形的CS组和对照组进行分析时发现,单个位点Logistic回归分析示WNT3A-rs766972的A/G相对于G/G-A/A为保护性因素(OR=0.53,95%CI=0.30-0.94,P=0.031)。在对胸椎畸形的CS组和对照组进行分析时发现,WNT3A-rs6672559的A/A相对于G/G-A/G为保护性因素(OR=0.41,95%CI=0.19-0.88,P=0.018)。这些分析结果说明WNT3A遗传多态性和CS易感性无关,对中国汉族人群来说,WNT3A基因的遗传变异可能与CS发病相关联,进一步的分析说明WNT3A基因对无肋骨畸形的先天性脊柱侧凸、有肋骨畸形的先天性脊柱侧凸以及有胸椎畸形的先天性脊柱侧凸均有关联。结论●在中国汉族人群中HES7、LMX1A、TBX6和WNT3A基因多态性与先天性脊柱侧凸发病相关,有可能是决定CS个体遗传易感性的重要因素。●HES7基因对于有分节障碍和有胸椎畸形的先天性脊柱侧凸发病来说是易感基因;LMX1A可能是有形成障碍的先天性脊柱侧凸和有肋骨畸形的先天性脊柱侧凸的易感基因;TBX6基因可能是无肋骨畸形的先天性脊柱侧凸、有肋骨畸形的先天性脊柱侧凸以及有胸椎畸形的先天性脊柱侧凸的易感基因;WNT3A基因可能是有分节障碍的先天性脊柱侧凸、无肋骨畸形的先天性脊柱侧凸、有肋骨畸形的先天性脊柱侧凸以及有胸椎畸形的先天性脊柱侧凸的易感基因。●在中国汉族人群中DLL3、DVL2、MYLK、NOTCH1、PAX1、SIM2基因可能与先天性脊柱侧凸的发病不相关。