肾癌又称肾细胞癌,肾腺癌,起源于肾小管上皮细胞,85%为透明细胞癌,还有一部分为颗粒细胞癌及混合细胞癌,是最常见的肾脏实质恶性肿瘤,其患病率占全身恶性肿瘤的3%,占肾脏肿瘤的85%以上。约25%的患者存在肿瘤转移。肾癌的转移可早可晚,少数原发肿瘤体积还很小或未被发现时已有远处转移,单纯依靠肿瘤分期和细胞分级判断肾癌预后已经显示出其局限性。以往的研究已经报道了大量的肿瘤分子标记物可用以辅助判断肾癌的预后,但是目前尚未发现一种独立、可靠的反映肿瘤浸润转移能力的预测指标。肾癌治疗主要依赖外科手术治疗,术式包括传统肾癌根治术和保留肾单位的肾部分切除术,最近的研究证明,单纯依靠肿瘤分期分级为依据选择肾癌手术术式亦具有局限性,临床上急需一种能反映肿瘤浸润、转移能力的指标作为辅助术式选择的新依据。CCN3基因,又名肾母细胞瘤过表达(NOV nephroblastoma overexpressed)基因,属于CCN基因家族。CCN家族由富含半胱氨酸蛋白61、结缔组织生长因子、肾母细胞瘤过表达基因NOV、WNT1可诱导信号转导途径蛋白1(Wnt-induced-secreted-protein-1,WISP-1)、WNT1可诱导信号转导途径蛋白2(WISP-2)及可诱导信号转导途径蛋白3(WISP-3)组成。CCN基因家族是一类编码细胞外分泌蛋白的基因,其编码的CCN蛋白通过与其他信号分子的相互作用参与并调节机体重要的生命活动。如在胚胎发生中促进心血管系统的发育、骨和软骨形成以及软骨内骨化；在成人体内还影响血管形成和组织的损伤修复以及炎症反应等。近年来的研究发现,在肿瘤中CCN3蛋白参与并调节肿瘤细胞生长、粘附、迁移以及细胞的存活与凋亡,调控肿瘤血管发生,CCN3基因的突变和表达异常与许多肿瘤的发生发展相关,对肿瘤的诊断和预后具有重要价值。以往的研究表明,CCN3在肾癌组织中异常表达。提示CCN3与肾癌的发生发展密切相关。此外,有学者发现CCN3在某些肿瘤如骨肉瘤,乳腺癌中具有很好的预后价值,并可以指导手术方式的选择。我们以前的研究结果也提示CCN3在肾透明细胞癌中表达水平可能与肾透明细胞癌的分期分级密切相关。然而,CCN3蛋白表达与肾透明细胞癌发生发展的关系及其机制尚不明朗,也尚未见到CCN3作为肾透明细胞癌的预后因子的报道。CCN3作为一种可能的肾透明细胞癌预后因子,具有很高的研究价值和临床应用前景。本研究旨在通过使用质粒转染的方法使肾透明细胞癌细胞株中CCN3蛋白过表达,研究其对肾透明细胞癌细胞的增殖,黏附,迁移,侵袭能力的影响,并研究其可能的分子生物学机制。另一方面,通过整理收集我院病例库中40名肾透明细胞癌患者的随访结果,手术切取肿瘤组织并结合组织芯片技术,进一步分析CCN3在肾透明细胞癌中的预后价值。此外,通过对组织芯片进行免疫组织化学染色,研究CCN3与其他影响肾透明细胞癌预后的分子生物学标记物如Ki-67, VEGF以及P27之间的联系,联合实时定量PCR技术,对CCN3在肾透明细胞癌中的作用机制进行研究。第一部分肾母细胞瘤过表达基因对肾透明细胞癌细胞生物学行为的影响及其作用机制目的探讨研究肾母细胞瘤过表达基因(nephroblastoma overexpressed, NOV)的表达对肾透明细胞癌细胞增殖、黏附、侵袭和迁移能力的影响。方法构建CCN3(NOV)过表达真核细胞重组表达质粒pEGFP-Cl-NOV,利用脂质体转染的方法转染人肾透明细胞癌细胞株786-0,并通过荧光显微镜监测转染效率。利用G418高压筛选的办法获得转染效率高的细胞。利用RT-PCR以及Western Blot技术分别在基因水平和蛋白水平检测CCN3蛋白在实验组(转染pEGFP-Cl-NOV质粒的786-0,786-O-CCN3),空载组(转染pEGFP-Cl质粒的786-0,786-O-empty vector)以及空白对照组(未转染的786-0)的表达水平。通过计数细胞绘制生长曲线和水溶性四氮唑法(WST-1)检测细胞生长抑制率,比较转染实验组与空载转染组及空白对照组的细胞增殖能力的差异。通过细胞黏附试验比较转染实验组与空载转染组及空白对照组的细胞黏附能力的差异。通过侵袭实验和细胞迁移试验,比较转染实验组与空载转染组及空白对照组的细胞细胞侵袭和迁移能力的差异。。结果实时定量PCR结果显示,786-O-CCN3(实验组)中CCN3基因的表达明显高于786-0-empty vector(空载组)及786-0(空白对照组)(P<0.05),而空载组与空白对照组之间CCN3基因表达无明显差异。Western Blot结果显示,实验组CCN3蛋白的表达明显高于空载组及空白对照组(P<0.05),而空载组与空白组之间CCN3基因表达无明显差异。细胞生长曲线和WST-1实验均显示,实验组细胞生长速度变慢,增殖活性受到明显抑制,与空白对照组相比48h、72h抑制率分别为29.14%、32.46%(P<0.05),而空载组与空白对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；细胞黏附实验显示：实验组细胞与层黏连蛋白和人纤维连接蛋白的细胞黏附率分别为0.26±0.03和0.28±0.04,均显著高于空白对照组(0.15±0.01,0.12±0.10)和空载组(0.14±0.02,0.13±0.08)(P<0.05),而空载组与空白对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);细胞侵袭实验显示：实验组细胞穿越Matrigel基质胶的细胞数(240.25±23.12),显著高于空白对照组(56.16±6.25)和空载组(50.28±7.13)(P<0.05),而空载组与空白对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);细胞迁移实验显示：实验组细胞迁移通过聚碳酸酯微孔滤膜的细胞数为267.25±20.94,显著高于空白对照组(66.10±5.68)和空载组(56.28±4.11)(P<0.05),而空载组与空白组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论虽然CCN3(NOV)可抑制肾癌细胞的增殖,但却促进肾癌细胞的黏附、侵袭和迁移。第二部分肾母细胞瘤过表达基因在肾透明细胞癌中的表达与其他分子生物学标记物的表达之间的关系。目的从基因水平和蛋白水平研究肾透明细胞癌中CCN3的表达与Ki-67,VEGF, p27, COX-2以及金属基质蛋白酶家族(MMPs)表达的关系,进而探讨CCN3对肾透明细胞癌作用的分子生物学机制。方法使用实时定量PCR技术,通过比较786-O-CCN3(实验组)与786-O-empty vector(空载组)及786-0(空白对照组)的细胞中金属基质蛋白酶-1,2,3,7,9,13(MMP-1,2,3,7,9,13)以及Ki-67,P27,VEGF和COX-2mRNA表达的差异,在基因水平研究CCN3对肾透明细胞癌可能的作用机制。收集我院病例库中的肾透明细胞癌患者40例,手术切取癌组织,以2例良性肾组织作为对照,构建组织芯片。应用免疫组化染色法对芯片组织进行CCN3免疫组化染色,并应用免疫组化染色法对芯片组织进行Ki-67, VEGF, P27, COX-2染色。应用Pearson相关性分析研究这几项分子生物学指标与CCN3表达之间是否存在相关性。结果实时定量PCR的研究结果表明,与对照组(786-0)细胞和空载组(786-O-empty vector)相比,实验组(786-O-CCN3)细胞内Ki67、VEGF在基因水平表达降低,P27、COX-2表达升高,且差异具有统计学意义(P<0.05)。而对照组与空载组的差异无统计学意义(P>0.05)。对金属蛋白酶家族(MMPs)的研究中,与对照组细胞和空载组相比较,实验组细胞内MMP-1, MMP-3、MMP-9的mRNA表达水平升高,且差异具有统计学意义(P<0.05)。而对照组与空载组的差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化染色结果显示,与对照组(正常肾组织)相比较,透明细胞癌组织中CCN3表达明显降低,差异有统计学意义。Ki-67在肾透明细胞癌组织中的表达与CCN3(NOV)的表达呈负相关,Pearson相关系数为-0.788(P<0.01)；P27在肾透明细胞癌组织中的表达与CCN3(NOV)的表达呈正相关,Pearson相关系数为0.521(P<0.01)；COX-2在肾透明细胞癌组织中的表达与CCN3(NOV)的表达呈正相关,Pearson相关系数为0.521(P＜0.01);VEGF在肾透明细胞癌组织中的表达与CCN3(NOV)的表达呈负相关,Pearson相关系数为-0.397(P<0.05)。结论CCN3在肾透明细胞癌中的作用可能与它影响Ki67, VEGF, P27, COX-2以及MMPs的表达有关。第三部分肾母细胞瘤过表达基因在肾透明细胞癌组织中的表达与肾透细胞癌预后的关系目的研究CCN3的表达水平与肾透明细胞癌预后的关系。方法应用我院病例库中的肾透明细胞癌患者40例,收集这些病例的随访资料,建立肾癌患者数据库。收集手术切取的此40例肾癌组织,并取10例良性肾组织作为对照,分级构建组织芯片。应用免疫组化染色法对芯片组织进行CCN3免疫组化染色,根据染色结果对CCN3的表达进行评级。CCN3着色比正常肾组织高的被归为CCN3表达较高组,CCN3着色比良性肾组织低或者相同的的被归为CCN3表达较低组。肿瘤特异性生存时间(CSS)的差异应用Kaplan-Meier生存分析中的log-rank检验。结果CCN3高表达组与CCN3低表达组相比较,肿瘤特异性生存时间(CSS)缩短(P<0.05)。结论CCN3的表达与肾透明细胞癌的预后相关,CCN3的高表达预示肾透明细胞癌预后不佳,可以作为一种新颖的预后因子,应用于肾透明细胞癌的预后的判断。