论文部分内容阅读
盐胁迫能够影响植物的根系结构，目前研究表明SOS信号途径在低盐胁迫促进根系生长中发挥重要作用，而对于高盐胁迫抑制根系结构的机制仍不清楚。LRR型受体蛋白激酶是数目最庞大的激酶家族之一，广泛参与植物生长发育、响应外界环境变化等途径。前期研究在水稻根尖组织中鉴定了新的盐胁迫响应LRR型受体蛋白激酶OsRPK1，本文旨在通过过表达与抑制表达OsRPK1转基因水稻研究其参与高盐胁迫调节根系结构的机制。 对OsRPK1序列进行生物信息学分析表明OsRPK1基因有两个异构体，分别为LOC_Os05g40770.1和LOC_Os05g40770.2，PCR扩增只检测到LOC_Os05g40770.1异构体，而未检测到LOC_Os05g40770.2，所以我们以LOC_Os05g40770.1为研究对象。该基因具有18个外显子和17个内含子，CDS区含有2910bp核苷酸，共编码969个氨基酸。分析蛋白质结构表明OsRPK1含有典型LRR型受体蛋白激酶的四个结构域。进化树分析结果表明OsRPK1蛋白在其它植物基因组中没有同源关系很近的同源蛋白，说明OsRPK1蛋白是一个新型的LRR型受体蛋白激酶。结合半定量RT-PCR和Genevestigator数据库微列阵数据分析发现OsRPK1基因在生长素含量较高的部位如根尖、叶片、茎间、胚芽鞘表达量最高;OsRPK1的表达主要受生长素(2，4-D、IAA)和150mMNaCl、16％PEG6000诱导表达，而30mMNaCl和80mMNaCl对OsRPK1表达量没有明显影响。这表明OsRPK1可能与生长素和高盐引起的渗透胁迫有关。 原核表达OsRPK1胞外LRR区获得融合蛋白GST-OsRPK1-LRR，利用同位素H3标记的IAA与未被同位素标记的IAA竞争结合GST-OsRPK1-LRR和ITC法分析IAA与GST-OsRPK1-LRR相互作用实验都表明GST-OsRPK1-LRR与生长素不结合。将OsRPK1基因正反向插入pGSA1285获得正反义植物表达载体，分别通过农杆菌EHA105介导遗传转化野生型日本晴水稻愈伤，抗性筛选愈伤、分化成苗。NorthernBlot检测转基因水稻OsRPK1表达量，确定获得OsRPK1过表达植株O1、O7和OsRPK1抑制表达植株A5、A7、A9。 正常生长条件下，抑制表达OsRPK1可以促进转基因水稻生长，例如侧根和不定根增多、根尖分生区和伸长区发达、叶片和叶鞘细胞膨胀、植株增高、分蘖数变多。相比之下，过表达OsRPK1转基因水稻则表现出相反的表型。OsRPK1能够影响水稻愈伤大小，并且IAA处理后抑制表达植株质膜H+-ATPase活性显著上升，而过表达植株几乎没有变化。通过HPLC测定转基因水稻和野生型水稻不同部位的生长素含量，结果表明OsRPK1抑制表达转基因水稻从根茎结合区到根尖的生长素含量都比OsRPK1过表达转基因水稻和野生型高。生长素转运抑制剂(NPA)处理观察其根部表型，发现OsRPK1抑制表达转基因水稻对生长素转运抑制剂不敏感，不定根仅下降29％，侧根下降35％。利用H3-IAA同位素示踪显示OsRPK1过表达转基因植株茎部H3-IAA的含量明显要比OsRPK1抑制表达转基因水稻和野生型水稻少，同时添加NPA后发现H3-IAA的含量都相对减少。这些结果表明OsRPK1参与生长素信号转导和极性运输。 正常生长条件下，OsRPK1过表达植株的侧根和不定根发生和生长受到明显的抑制，且在分子水平上抑制大部分生长素转运基因PINs、Aux/IAXs和诱导生长素早期响应基因Aux/IAAs的表达，这与高盐胁迫下野生型水稻表型和生长素转运基因PINs、Aux/IAXs表达模式相似。而OsRPK1抑制表达植株耐盐性增强，侧根、不定根与PINs、Aux/IAXs表达都未受明显的影响。因此我们认为，OsRPK1在正常生长情况下保持低水平表达，高盐胁迫能够诱导其表达。高水平表达OsRPK1一方面抑制生长素转运基因PINs、Aux/IAXs表达，降低生长素在根部的极性运输和含量;另一方面，高水平表达OsRPK1还可诱导Aux/IAAs表达，由于Aux/IAAs阻遏生长素信号途径，导致下游生长素响应基因的表达，从而共同抑制侧根和不定根的发生和形成。 综上所述，OsRPK1是一个新型的，定位于质膜的LRR受体蛋白激酶，在高盐胁迫下，能够通过生长素信号转导和极性运输调控水稻根系结构。