结核分枝杆菌仍然是巨大的公共卫生威胁。胆固醇作为结核分枝杆菌特征性碳源,对在其宿主巨噬细胞中的生存至关重要。GlnR作为氮代谢全局性调控因子,在响应环境氮源信号调控氮代谢的同时,也能调控碳、磷等营养元素的代谢。此外SenX3/RegX3作为磷源感知双组分调控系统在调控磷代谢的同时,也能协调调控碳源代谢。因此,氮、碳和磷在维持机体正常生理功能及提供能量外,它们彼此之间存在着复杂而又精巧的协同调控作用。胆固醇是结核分枝杆菌在巨噬细胞中存活和保持毒力的关键碳源,而分枝杆菌中胆固醇代谢机制仍未被彻底了解。在这里我们基于课题组的前期探索研究为基础,以GlnR和RegX3为媒介,进一步深入解析分枝杆菌中碳、氮、磷等营养元素的协同调控机制。具体研究内容如下:(1)GlnR介导的环境氮信号对耻垢分枝杆菌中胆固醇代谢的调控机制研究。我们通过生物信息学分析在kstR的启动子区域发现了一个典型的GlnR结合基序(CCGAC-AACAGT-GACAC),然后进行了电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)分析以确定体外结合。然后进行了实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)以分析与野生型(WT),glnR缺失的突变体(ΔglnR)和glnR补充性(ΔglnR::glnR)菌株在氮限制条件下与胆固醇降解相关的基因的差异表达。巨噬细胞ATP测试表明,GlnR-KstR的协同调节显著减少了耻垢分枝杆菌的侵袭。结果表明,参与胆固醇分解代谢的许多基因都通过KstR受到响应环境氮水平GlnR的调控,进而影响了耻垢分枝杆菌的入侵。(2)RegX3响应磷源信号对耻垢分枝杆菌中胆固醇转运的调控机制研究。首先采用生物信息学技术对RegX3蛋白的结构、功能及其结合motif进行预测分析,然后通过,EMSA实验初步证实RegX3可以直接结合mce4基因簇上游调控区的特征motif。然后进行了RT-qPCR实验分析了,与野生型(WT),regX3敲低的突变体(i regX3)和regX3过表达菌株(OE regX3)在磷限制条件下胆固醇转运mce4基因簇转录表达差异。生长曲线及刃天青表型实验表明,RegX3促进了耻垢分枝杆菌的生长与存活。结果表明,胆固醇转运子mce4基因簇许多基因都受到响应环境磷水平RegX3的调控,从而影响了耻垢分枝杆菌的生长和存活。通过以上研究,我们揭示了耻垢分枝杆菌响应环境氮、磷信号对胆固醇转运、代谢的调控机制,这为分枝杆菌在宿主细胞内的生存控制提供了新的策略。