论文部分内容阅读
前言 间盘增龄与退变过程中，在多种因子刺激下间盘细胞启动了细胞外基质酶促降解机制。基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是细胞外基质降解的主要蛋白酶。但是还可能有其它的蛋白酶参与了细胞外基质的降解过程。组织蛋白酶D（Cathepsin D）是一种天冬氨酰类溶酶体肽链内切酶，基因定位于染色体11p15，存在于多种组织细胞，主要分布在细胞内囊泡，溶酶体，吞噬体和次级内涵体内，参与结缔组织的分解代谢。本次实验采用免疫组织化学S-P法和RT-PCR法检测人腰椎间盘细胞Cathepsin D蛋白表达。探讨Cathepsin D与人椎间盘生理和病理条件下细胞外基质改变的关系。 实验对象 实验所用间盘取自术中（2002年6月至2003年11月在中国医科大学附属第一医院骨科手术治疗的患者），退变组30例（腰椎间盘突出症患者，男17例，女13例，17～66岁。）；正常组间盘10例（胸腰段骨折行前路手术患者，取损伤节段的邻近未损伤间盘，并经MRI T2加权间盘信号改变程度验证其为正常间盘，男7例，女3例，29～46岁。）。 实验方法 一、HE染色组织学观察 4μm石蜡切片经脱腊至水，苏木素浸染10分钟，蒸馏水15分钟，而后伊红染色数秒钟，封片后显微镜观察。 二、免疫组织化学S-P法检测椎间盘细胞Cathepsin D蛋白表达 4μm石蜡切片经脱腊至水，用体积分数3％的H2O2室温孵育10分钟，封闭内源性过氧化氢酶；PBS浸泡冲洗3次，每次4分钟；5％正常山羊血清室温孵育20分钟封闭非特异性染色；滴加鼠抗人Cathepsin D单克隆抗体适量，4℃过夜;PBS浸泡冲洗3次，每次4分钟;滴加生物素化山羊抗小鼠IgG37℃20min;DAB显色;麦氏苏木素轻度复染，封片后显微镜观察。 三、逆转录一聚合酶链式反应（RT一PCR）检测CathePsinD基因mRNA转录水平 应用primer 5 .0软件设计CathepsinD引物:上游为19一mer，5’一CT-GTGGAGGACCTGA，IVr GC一3飞下游为21一mer，5’一CTGCACTTGTCGCTGTT.GTAC一3‘。CathepsinD预计扩增片段为262bp。并选用日肌动蛋白（p-aetin）为参照物，半定量检测CathepsinD基因转录水平。 （1）提取总RNA。（2）逆转录反应合成cDNA，反应条件:65℃1而n一30℃smin一15一30min内匀速升温至65℃一65℃30而n一98℃5而n一5℃smin;（3）pCR反应扩增，反应条件:①94℃3而n一②84℃45Se。一③56.7℃lmin一④72℃lmin一⑤72℃7而n。②一④循环35次;（4）PCR产物电泳和半定量分析。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，用Kodak，ID型凝胶成像系统进行图像采集和电泳带积分光密度测定，以CathePsinD条带的吸光度容积与日一actin条带的吸光度容积的比值作为目的基因mRNA的相对含量。 四、统计分析 利用SPSS 1 0 .0 For Windows统计软件进行t检验。实验结果 一、HE染色组织学观察 在退变组间盘中，纤维环原有的板层结构紊乱，细胞数量减少，失去原有软骨细胞形态，常有多个细胞被晕轮环绕，部分细胞胞浆成分极少。 二、免疫组织化学S一P法检测椎间盘细胞CathePsinD的蛋白表达 CathensinD阳性染色呈黄棕色颗粒，位于细胞浆。在正常间盘中，Ca-thePsinD阳性细胞率低;个别间盘阳性率高。在退变间盘中，CathePsinD阳性率较高，但也有个别间盘阳性率低。 三、逆转录一聚合酶链式反应（RT一PCR）检测CathePsinD基因mRNA转录水平 CathePsinD基因mRNA转录水平在正常间盘中表达水平除2例外均呈低表达。在退变间盘中，多数间盘呈高表达。 四、统计分析结果: 退变组表达水平高于正常组。t检验分析证实组间差异有统计学意义（P<0 .01）。讨论 间盘退变的是椎间盘细胞外基质的改变及基质与细胞粘附功能减退导致的细胞调亡。这些基质合成与破坏不平衡提示在椎间盘细胞外基质中存在调控基质代谢的酶系统。 基质金属蛋白酶（MMPs）和金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）两个酶系统在人椎间盘退变时细胞外基质改变过程中发挥着重要作用。除MMPs外，对细胞外基质有降解作用的蛋白酶也可能参与人椎间盘的退变过程。近十年的研究表明，CathePsinD可降解部分细胞外基质成分。 CathePsinD和MMPs间一个显著差别是它们的最适PH值不同。MMPs近中性，而CathePsinD则为偏酸性。间盘是体内最大的无血运组织，低氧时细胞无氧代谢增加，为CathePsinD发挥蛋白水解酶作用，破坏细胞外基质提供了适宜条件。 在与调亡有关的多项研究中，多种因素诱导的细胞调亡过程均有Ca-thePsinD的参与，并且用胃酶抑素A预处理时，调亡过程被阻断。在间盘退变中发生的细胞调亡也可能有CathePsinD的参与。 CathePsinD的调控因子还不清楚，它们即可能来自侵入间盘的血管，或是来自侵人间盘的巨噬细胞，另外间盘细胞本身也能合成一些细胞因子，它们均可能与CathePsinD的调控有关，这些都还有待进一步阐明。结论CathepsinD与人腰椎间盘退变有关。