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早期断奶会引起仔猪肠道屏障功能损伤,因此研究肠道粘膜屏障功能损伤及其发生机制,并寻求安全有效的营养调控措施,已经成为畜牧业健康可持续发展的必然趋势。研究表明,多糖与机体免疫功能的调节、细胞分裂和分化以及疾病的发生和发展等都有着密切的关系。白术多糖作为健脾益气中草药白术的有效成分,在调节肠道微生物区系平衡和肠道粘膜免疫功能等方面具有较强的活性,然而白术多糖对肠粘膜损伤的调控作用及其机制还有待研究。本研究在白术多糖提取制备及结构表征的基础上,采用葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导小鼠结肠炎及猪肠道上皮细胞IPEC-J2损伤模型,利用微生物组测序技术、基因沉默技术、RNA-Seq及lncRNA-Seq高通量测序技术等手段,从整体-细胞-分子水平研究了白术多糖对肠道粘膜屏障功能损伤的调控作用及分子机制,为白术多糖作为肠道功能调节制剂的研发和在断奶仔猪上的应用提供理论依据。具体内容和结果如下:1.白术多糖的制备及结构表征粉碎机粉碎生白术,利用水提醇沉、Sevag法和酶法相结合去除蛋白质、透析纯化制备白术精多糖AMP,得率为5.83%。理化性质分析显示AMP总糖含量为96.58%,糖醛酸含量为11.52%,不含蛋白质、核酸等物质。高效凝胶过滤色谱法分析表明AMP为分子量均一的多糖组分,重均分子量Mw为3714 Da;高效液相色谱分析表明AMP由甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖及阿拉伯糖组成,其摩尔百分比为1.57%:0.23%:0.22%:2.05%:0.47%:4.68%:58.38%:9.21%:0.29%:22.94%;红外光谱结果显示AMP具有多糖特征吸收峰;核磁共振分析结果表明,AMP以1,3-β-D-Galp 和 1,6-β-D-Galp 连接为主。2.白术多糖对DSS诱导肠粘膜屏障损伤的调控作用40只体重相近的雄性SPF级C57/BL6小鼠,随机分为4组:分别为对照组、DSS模型组、AMP组和DSS+AMP组。采用3%DSS成功诱导小鼠肠粘膜屏障损伤模型,研究白术多糖对肠道粘膜屏障损伤的调控作用。结果显示:（1）在表观指标方面:AMP能缓解DSS诱导的小鼠体重减轻和结肠长度缩短（P<0.05）,改善病理状态。（2）在物理屏障功能方面:AMP能显著改善DSS诱导的小鼠回肠和结肠形态损伤;DSS处理显著下调了结肠Claudin-1、Occludin和ZO-1 mRNA相对表达量（P<0.05）;与DSS组相比,DSS+AMP组结肠组织紧密连接蛋白Claudin-1 mRNA 表达量极显著上调（P<0.001）,Occludin和ZO-1 mRNA相对表达量上调,Western Blot结果与之相一致,提示AMP可以降低肠道通透性,保护肠道物理屏障稳态。（3）化学屏障功能方面:DSS诱导小鼠结肠组织MUC-1和MUC-2mRNA表达量显著下降（P<0.05）,AMP可显著提高MUC-2表达量（P<0.05）;免疫组化分析MUC-2的蛋白表达情况与q-PCR结果一致,说明AMP可以增强肠道化学屏障。（4）免疫屏障功能方面:AMP处理能缓解DSS诱导小鼠中性粒细胞浸润,抑制DSS诱导的小鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达量的升高（P<0.001）以及结肠组织中IL-1β和IL-6含量升高（P<0.05）。（4）生物屏障功能方面:DSS处理能够降低肠道微生物数量及多样性,并且显著改变其群落构成,导致肠道菌群失调。AMP处理通过减少有害菌如Clostridiumsensustricto1（P<0.01）的丰度,增加潜在有益菌如Faecalibaculum（P<0.05）的丰度,对DSS诱导小鼠肠道菌群紊乱起到一定的调节作用。以上结果表明AMP可以缓解DSS诱导的肠粘膜屏障损伤。3.白术多糖对DSS诱导肠粘膜屏障损伤的调控机制研究在体内实验的基础上,进一步构建DSS诱导猪肠道上皮细胞（IPEC-J2细胞）屏障损伤模型,探讨AMP对DSS诱导的肠粘膜屏障损伤的调控机制。结果表明:（1）在IPEC-J2细胞增殖和凋亡方面:以不同浓度的AMP孵育IPEC-J2细胞24小时,用CCK8法测定细胞活力显示,浓度为2-200 μg/mLAMP显著增加了细胞活力（P<0.05）;用3%DSS建立IPEC-J2细胞损伤模型,选取浓度为5、25和50 μg/mL的AMP进一步探究其对细胞的保护作用。与DSS组相比,25和50 μg/mL AMP极显著提高了 IPEC-J2细胞存活率（P<0.01）,保护细胞免受DSS的损伤,且具有剂量依赖性;利用流式细胞术分析发现,25和50 μg/mL AMP极显著降低了DSS诱导的细胞凋亡（P<0.01）。（2）在肠上皮屏障方面:与 DSS 组相比,50 μg/mL AMP使得IPEC-J2细胞Occludin、Claudin-1和ZO-1的mRNA表达量分别极显著地提高了 2.41、12.32和78.81倍（P<0.01）;免疫荧光结果显示25 mg/mL AMP可以防止DSS导致的细胞紧密连接蛋白错乱分布;q-PCR检测促炎因子mRNA的表达发现,5、25及50μg/mLAMP可以极显著逆转DSS诱导的促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表达上调（P<0.01）,并且具有浓度依赖性。（3）AMP作用的机制方面:利用lncRNA-seq进行高通量测序,通过KEGG通路富集筛选出紧密连接通路中上调变化最大的lncRNA,命名为 lncRNA ITSN1-OT1。利用 RNA FISH 技术对 DSS+AMP 组中 lncRNA ITSN1-OT1进行亚细胞定位,结果表明ITSN1-OT1主要在细胞质中表达。通过RNA干扰技术抑制ITSN1-OT1的表达发现,siITSN1-OT1组中添加AMP不能增加细胞中紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1的mRNA和蛋白表达量。采用RNA-seq和lncRNA-seq基因表达联合分析发现,STAT2是与ITSN1-OT1相关性最强的基因。进一步研究发现,lncRNAITSN1-OT1可以阻断磷酸化STAT2蛋白（p-STAT2）入核。以上结果提示,AMP可以通过上调lncRNA ITSN1-OT1阻断p-STAT2的入核转运,防止DSS诱导的猪肠道上皮细胞紧密连接蛋白表达的下降和结构破坏,来维持肠道屏障功能。综上所述,本研究首先利用水提醇沉法提取并纯化得到白术精多糖,并对其结构进行初步解析,在此基础上,利用体内外试验阐明了白术多糖AMP对DSS诱导的肠粘膜屏障损伤的保护作用,并初步揭示其作用的分子机制,为白术多糖作为肠道功能调节剂的应用提供了理论依据,并为断奶应激条件下仔猪肠道粘膜屏障功能调控和健康研究奠定了基础。