论文部分内容阅读
本文以我国水体中常见的水生植物水花生(Alternanthera philoxeroides)和慈姑(Sagittaria sagittifolia)的植物体为实验材料,研究了被污染水体中的常见重金属离子Cu2+对这些植物体内的活性氧水平和多胺代谢的影响,以及外源施用亚精胺(Spd)对水花生Cu2+毒害的缓解作用。并通过植物组织培养技术培养出了水花生的愈伤组织,并研究了Cu2+对水花生愈伤组织内的活性氧水平和抗氧化系统的的影响。另外,利用抑制性消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization, SSH)技术构建了Cu2+胁迫下菹草(Potamogeton crispus)的SSH文库,并对该文库中差异表达基因做了分析。具体研究结果如下：(1)研究了不同浓度的Cu2+对水花生叶片内的活性氧水平和多胺代谢的影响,以及外源施用Spd对水花生Cu2+毒害的缓解作用。Cu2+处理使水花生叶片内Cu大量积累,同时硫巴比妥酸反应物(TBARS)含量、过氧化氢(H2O2)含量增加,并提高了超氧阴离子(O2·-)的产生速率。Cu2+处理也显著增加了水花生叶片内腐胺(Put)的含量,但是降低了Spd和精胺(Spm)的含量。随着Cu2+处理浓度的升高,水花生叶片内的精氨酸脱羧酶(ADC)、鸟氨酸脱羧酶(ODC)和多胺氧化酶(PAO)活性都显著升高。但是,当外源施用Spd后,水花生叶片内的H202含量明显减少,超氧阴离子(O2·-)的产生速率也有所下降。外源施用Spd减少了水花生叶片内Cu的积累,从而减轻了Cu2+引发的膜脂过氧化程度。而且,外源Spd的施用降低了水花生叶片的内源Put含量,增加了Spd和Spm的含量；ADC. ODC和PAO活性也被有效降低了。这些结果表明,外施Spd可以通过减少活性氧水平和平衡多胺代谢来提高水花生对Cu2+的抗性。(2)研究了不同浓度的Cu2+对慈姑根细胞内Cu积累量、02·-产生速率、TBARS含量、多胺含量以及ADC和PAO酶活性的影响。通过对上述生理生化指标的测定,以期研究慈姑体内抵抗重金属胁迫的机制。研究发现,慈姑根细胞内Cu含量随着Cu2+处理浓度的增加逐渐增加,并表现出与处理浓度之间显著正相关。同时,O2·-产生速率也在不断增大。当Cu2+处理浓度小于5μmol·L-1时,慈姑根细胞内的TBARS含量表现出逐渐上升的趋势。同时,发现慈姑根细胞内的ADC活性也在不断提高。较低的Cu2+处理浓度(2.5μmol·L-1和5μmol·L-1)对游离态(free) Put含量和高氯酸可溶性结合态(PS-conjugated) Put含量有较大的提高作用。不同浓度的Cu2+处理也对高氯酸不溶性束缚态(PIS-bound) Put含量均有提高的作用。从Put总量看来,每个Cu2+处理组的慈姑根细胞内的Put含量都比对照组高。当Cu2+处理浓度小于10μmol·L-1时,慈姑根细胞内的PAO活性受到抑制,但当Cu2+处理浓度大于20μmol·L-1时,PAO活性显著提高。这正是慈姑根细胞内的free Spd含量、PS-conjugated Spd含量以及三种形态的Spm含量先上升后下降的原因。但是从总量看来,随着Cu2+处理浓度的增加,慈姑根细胞内的Spm总量逐渐增加,而Spd总量却是呈现下降的趋势。这些结果表明,Cu2+浓度过高对慈姑是有害的。虽然Spmn含量有所增加,但是这并不足以抵抗Cu2+引发的氧化损伤。(3)研究了水花生的愈伤组织在用不同浓度的Cu2+处理后,其体内可溶性蛋白含量、TBARS含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、愈创木酚-过氧化物酶(G-POD)活性以及02·-和H202等活性氧水平的变化。当用0.05mmol·L-1Cu2+处理时,水花生愈伤组织内的可溶性蛋白含量升高,而O2·-和H202含量却下降。当Cu2+处理浓度超过0.1mmol·L-1时,水花生愈伤组织内的可溶性蛋白含量明显减少,在SDS-PAGE图中可以看到分子量约为45kDa和39kDa的多肽条带出现；由于此时水花生愈伤组织内02·-大量积累,SOD活性随之显著提高；由于H202含量的增加,水花生愈伤组织内的POD和CAT活性也交替上升,最终,在POD和CAT的共同作用下,H202含量降至一个比较低的水平。随着Cu2+处理浓度的不断增大,TBARS含量逐渐减少。这些结果表明,水花生愈伤组织内的抗氧化酶(SOD、POD和CAT)在其抵抗Cu2+胁迫时发挥了重要作用,尤其是SOD作用更显著。(4)为了研究Cu2+胁迫下菹草体内的特异表达基因,利用SSH技术构建了Cu2+胁迫下菹草的双向SSH文库。其中以Cu2+处理的菹草为试验方(Tester),以不加Cu2+处理的菹草为驱动方(Driver)进行正向消减杂交；以不加Cu2+处理的菹草为试验方(Tester),以Cu2+处理的菹草为驱动方(Driver)进行反向消减杂交。分别提取Cu2+处理和不加Cu2+处理的菹草的总RNA,反转录合成cDNA第一链,进而合成cDNA第二链,然后依次经过Rsa Ⅰ酶切、接头连接、两轮消减杂交和两轮PCR,最后获得正、反向消减杂交产物。将正、反向SSH获得的杂交产物插入pED-T载体中,转化感受态细胞DH5α。对文库中的阳性克隆测序后主要通过Gene Ontology数据库进行GO分析并通过KEGG数据库进行代谢通路(pathway)分析。分析结果表明,大多数差异表达基因都与代谢过程相关,涉及到相关代谢通路中的一些酶基因。