研究目的流行病学调查显示超过80%的人一生中都会经历颈肩痛（neck and shoulder pain）或者下腰痛（low back pain）,颈腰痛对人们的生活和工作造成了巨大的影响,一般认为颈腰痛主要是由椎间盘退变（intervertebral disc degeneration,IDD）发展而来。然而,由于对椎间盘退变的机制研究仍不全面,使得临床治疗一直处于被动,非手术生物治疗应用十分缓慢,被迫选择手术治疗的患者需要面对相应并发症的风险,尤其是复发和邻近节段退变。因此,深入研究椎间盘退变的机制,对早期主动干预和减少手术率有着极为重要的意义。目前研究证实椎间盘退行性变是多因素参与的过程,包括遗传易感性、感染、生物力学负荷异常、衰老、终板营养转运障碍和吸烟等因素。研究表明,作为椎间盘退变的主要相关区域,髓核的变性是椎间盘退行性变的最初原因,细胞外基质的代谢失衡、炎症的发生发展和细胞凋亡是髓核变性的三种主要病理生理改变。基于既往研究,已有体外实验设法通过抗细胞因子和抑制相关信号通路,来达到修复损伤结构及减轻疼痛的治疗目的,然而,由于内环境的复杂性,给药途径和缺乏特异性靶点等因素导致其在临床中的运用停滞不前。因此,找到更多特异性靶点,完善机制网络显得十分重要。课题组前期通过蛋白联合转录组学分析不同退变等级的临床样本,发现骨化相关基因在退变组织中的表达显著高于正常组织,其中骨化相关基因FGF23差异尤为显著。因此,课题就FGF23在椎间盘退变中的作用及机制做进一步的探索,完善椎间盘退变机制网络的同时,也为创建新的生物治疗策略提供相关实验基础和理论依据。第一部分:高通量测序发现FGF23在退变髓核细胞中显著上调方法:（1）临床收集正常或轻度退变髓核组织,提取原代髓核细胞。（2）在体外培养原代髓核细胞,当细胞融合约80%时可进行传代。（3）提取髓核组织总蛋白,分为正常对照组和退变组,进行蛋白组学分析各组蛋白水平。（4）免疫组化检测各级髓核组织标本中FGF23蛋白表达含量。（5）免疫荧光检测和蛋白质印迹法（Western Blot）检测FGF23蛋白在不同浓度IL-1β作用下的表达变化。（6）ELISA检测各种髓核细胞分泌至细胞培液中的FGF23蛋白含量。（7）采用CCK8试剂盒摸索FGF23重组蛋白、FGF23中和抗体的实验浓度。结果:（1）原代髓核细胞培养并传P2-P4代。（2）蛋白组学分析提示退变组中MAPK通路显著激活,通路相关蛋白FGF23表达差异最显著。（3）免疫组化提示FGF23在椎间盘退变时表达上调。（4）免疫荧光检测及Western Blot检测提示细胞内的FGF23蛋白水平在IL-1β干预下显著上升,在IL-1β浓度为25ng/ml时达到峰值。（5）ELISA检测提示细胞外FGF23在IL-1β浓度为25ng/ml时上升至接近峰值水平。（6）CCK8实验检测提示FGF23重组蛋白在浓度为100ug/ml时,FGF23中和抗体在浓度为50ug/ml时,髓核细胞活性显著下降。结论:通过对人原代髓核细胞的培养获得了形态优良的P2-P4代髓核细胞,结合高通量组学分析及组织、细胞层面实验验证,发现分泌性蛋白FGF23在椎间盘退变时含量显著增加,提示其对椎间盘退变可能存在重要影响。摸索确定FGF23重组蛋白和中和蛋白干预的适合浓度。第二部分:FGF23对髓核细胞的影响方法:（1）不同浓度FGF23重组蛋白干预髓核细胞24小时后,流式细胞术检测髓核细胞凋亡比例;提取髓核细胞总蛋白,通过Western Blot检测凋亡相关蛋白表达变化。（2）干扰RNAsi FGF3转染退变髓核细胞48小时,流式细胞术检测髓核细胞凋亡比例;提取髓核细胞总蛋白,通过Western Blot检测不同组别中凋亡相关蛋白表达变化。（3）FGF23中和抗体刺激退变髓核细胞,流式细胞术检测髓核细胞凋亡比例;提取髓核细胞总蛋白,通过Western Blot检测不同组别中凋亡相关蛋白表达变化。（4）不同浓度FGF23重组蛋白干预后,通过Real-time RT-PCR和Western Blot检测细胞外基质代谢相关基因和蛋白在各组中表达变化。（5）干扰RNAsi FGF3转染退变髓核细胞48小时,Real-time RT-PCR及Western Blot检测不同组别中细胞外基质代谢相关基因和蛋白表达变化。（6）FGF23中和抗体刺激退变髓核细胞,Real-time RT-PCR及Western Blot检测不同组别中细胞外基质代谢相关基因和蛋白表达变化。结果:（1）随着FGF23浓度增加,流式细胞术检测提示凋亡的髓核细胞占比逐步上升;Western Blot检测提示促凋亡蛋白Cleaved caspase3、BAX表达水平显著上升,而抗凋亡蛋白Bcl2显著下调。（2）si FGF23的转染,显著缓解IL-1β对髓核细胞的促凋亡作用;显著削弱IL-1β诱导上调的促凋亡蛋白Cleaved caspase3、BAX表达及下调的抗凋亡蛋白Bcl2表达水平。（3）FGF23中和抗体表现出与si FGF23类似的作用,对退变髓核细胞具有抗凋亡作用,且具有一定浓度相关性。（4）细胞外基质降解代谢相关基因表达只有在高浓度FGF23重组蛋白干预退变髓核时显著下调。（5）si FGF23和FGF23中和抗体均具有促进髓核细胞外基质合成代谢的作用,而对降解代谢无影响。结论:采用FGF23重组蛋白,si FGF23以及FGF23中和抗体,在正常及退变髓核细胞中证实FGF23促进髓核细胞凋亡,同时抑制髓核细胞外基质合成代谢,而对降解代谢无明显作用。第三部分:STC2-PI3K/Akt通路介导FGF23促髓核退变的机制研究方法:（1）si FGF23转染IL-1β诱导退变的髓核细胞,收集细胞总RNA及蛋白,通过转录组测序筛选FGF23下游作用靶点。（2）采用FGF23重组蛋白和si FGF23分别处理正常和退变的髓核细胞,通过免疫荧光、Western Blot及Real-time RT-PCR实验检测STC2及PI3K/Akt通路相关蛋白表达变化。（3）STC2过表达质粒转染髓核细胞,48小时后添加FGF23重组蛋白刺激,24小时后,通过流式细胞术检测髓核细胞凋亡情况,凋亡相关蛋白以及PI3K/Akt通路相关蛋白表达情况采用Western Blot检测。（4）STC2过表达质粒转染髓核细胞,48小时后添加FGF23重组蛋白刺激,24小时后,通过Real-time RT-PCR和Western Blot检测细胞外基质代谢相关基因。（5）通路抑制剂LY294002处理si FGF23转染后的退变髓核细胞,通过流式细胞术,Real-time RT-PCR及Western Blot检测髓核细胞凋亡情况、凋亡相关蛋白以及细胞外基质代谢相关基因和蛋白。结果:（1）转录组学测序提示STC2和PI3K/Akt通路在干扰组显著差异。（2）FGF23对STC2和PI3K/Akt通路均存在负性调控作用,与转录组学测序结果吻合。（3）FGF23通过STC2促进髓核细胞凋亡,STC2介导FGF23对PI3K/Akt通路的调控关系。（4）STC2可以缓解FGF23对合成代谢相关基因的抑制作用。（5）PI3K/Akt通路对FGF23调控髓核细胞凋亡及髓核细胞外基质代谢具有重要影响。结论:首先通过转录组测序筛选FGF23调控椎间盘退变所依赖的下游靶点,进行周密验证;随后通过回复实验,分别就STC2和PI3K/Akt通路对FGF23调控髓核细胞凋亡及细胞外基质代谢的影响进行探索,明确FGF23通过STC2-PI3K/Akt通路调控椎间盘退变的内在机制。小结课题首次发现骨化相关基因FGF23在髓核细胞表达并分泌,且椎间盘退变程度越高,其表达水平也越高,进一步研究揭示FGF23可通过STC2-PI3K/Akt信号通路介导来诱导髓核细胞凋亡,抑制髓核细胞外基质合成代谢,进而促进椎间盘退变的进展。本课题研究补充并完善椎间盘退变相关机制网络,为挖掘相关生物靶点治疗提供了思路和理论基础。