硒化和酶解修饰改性对荔枝多糖结构和生物活性的影响

来源 :广东药科大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:shlchen
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本文以荔枝果肉多糖为对象,通过对纯化前后的多糖进行硒化和酶解修饰,并对修饰前后多糖的结构特征及其活性进行研究,旨在探明硒化和酶解处理改变荔枝多糖生物活性的构效机制,为荔枝多糖在功能性食品开发中的加工利用提供理论依据和技术支撑。主要的研究内容和结果如下:1荔枝粗多糖及其超滤级分的结构特性和免疫活性比较采用分子截留量为100 kDa的超滤柱对荔枝粗多糖(CLP)进行超滤纯化获得两个级分,分别命名为LP1和LP2,分别对CLP及超滤后的多糖级分的分子量、单糖组成等结构特征进行解析。结果表明,LP1和LP2得率分别为67.33%和6.95%,分子量分别为378.67 kDa和16.96 kDa;LP2的单糖组成与CLP较接近,而LP1的单糖组成则较CLP有明显的变化;红外光谱和碘-碘化钾结果表明CLP、LP1和LP2均是含有较长侧链和较多分支的α、β-D-吡喃型多糖。免疫活性结果表明LP1和LP2均能够增强巨噬细胞吞噬活性,促进NO、TNF-α和IL-6的分泌,并呈剂量效应关系,但LP2的活性高于LP1。2硒化修饰对荔枝多糖理化特性和生物活性的影响通过在60、70、80℃这三种不同温度条件下对LP1进行硒化修饰,获得3种硒化多糖,分别将其命名为LP1-Se-1,LP1-Se-2和LP1-Se-3。红外光谱分析显示这3种硒化多糖在916 cm-1处产生了C–O–Se伸缩振动峰,表明多糖已经被成功地硒化修饰。硒化修饰后,LP1-Se-3的硒含量最高,其次是LP1-Se-2,LP1-Se-1含量最少,而修饰前的LP1不含硒元素。免疫活性结果表明,三种硒化多糖的免疫活性均高于LP1,其中在刺激巨噬细胞分泌一氧化氮方面,LP1-Se-1的免疫活性最强,而在增强巨噬细胞对中性红的吞噬作用以及分泌TNF-α和IL-6的能力方面,LP1-Se-3则表现出更强的免疫活性。为了进一步阐明硒化修饰影响荔枝多糖生物活性的构效机制,通过DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析技术对LP1进行分离纯化,获得纯度和均一性较高的LP1-1,用于进一步进行改性修饰的构效机制解析。按照硒含量最高的荔枝多糖LP1硒化产物LP1-Se-3的硒化修饰条件对其进行硒化修饰。对荔枝多糖LP1-1及其硒化产物(LP1-1-Se)进行理化特性测定,结果表明,硒化修饰后,分子量和粒径均增加了;红外光谱结果显示在639 cm-1和607 cm-1有新的吸收峰,这两处的峰均是Se–O–C伸缩振动峰;碘-碘化钾结果显示LP1-1及其LP1-1-Se均含有较长的侧链和较多的支链;圆二色谱结果显示LP1-1存在不对称结构,LP1-1-Se无显著的Cotton效应。免疫活性结果显示,与修饰前相比,LP1-1-Se表现出更强的免疫活性。抑制肿瘤细胞增殖分析结果表明硒化修饰后的LP1-1表现出更强的抑制MCF-7、HepG2肿瘤细胞增殖能力。3酶解对荔枝多糖理化特性和生物活性的影响采用果胶酶对LP1进行酶解改性,以还原糖增加量为指标,对其改性条件进行优化,并对酶解前后LP1的结构特征和生物活性进行分析。结果表明,LP1的最优酶解条件为:pH为5.5,温度为40℃,时间为9 h,酶浓度为1500 U/g;酶解修饰后,LP1的中性糖、糖醛酸、蛋白质含量均降低,且表现出更强的免疫活性。为了进一步阐明酶解改性影响荔枝多糖生物活性的构效机制,后续选用纯度较高的LP1-1亚级份进行酶解改性前后的结构和生物活性比较研究。在LP1的最优酶解条件的基础上,结合对酶解产物分子量分析,确定出LP1-1的最适酶解条件:酶解pH为5.5,酶解温度为40℃,酶解时间为9 h,酶解浓度为2500 U/g。通过对LP1-1及其酶解产物(E-LP1-1-2)的理化特性进行测定,发现酶解修饰后,其中性糖、糖醛酸、蛋白质、分子量均降低;红外光谱结果显示LP1-1为α、β-D-吡喃型多糖;E-LP1-1-2为α型吡喃型多糖;碘-碘化钾结果显示LP1-1及其酶解多糖均存在较长的侧链和较多的支链;扫描电镜图谱显示,酶法改性后,LP1-1由片状改变为锯齿状;原子力显微镜结果显示,酶解修饰后,荔枝多糖级分LP1-1在水溶液的形貌由细长的链状变化至细小颗粒状,直径范围也相应缩小;圆二色谱分析显示E-LP1-1-2无显著的Cotton效应,而LP1-1则存在不对称结构。免疫活性结果显示酶解修饰后,LP1-1表现出更强的免疫活性。
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