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肿瘤细胞表达肿瘤抗原是诱发肿瘤免疫应答的关键,是机体识别肿瘤并激活免疫系统的物质基础。但大多数肿瘤抗原的免疫原性很弱,且宿主对肿瘤抗原的免疫应答导致肿瘤细胞表面抗原减少或丢失,而使肿瘤细胞不被免疫系统识别,不能诱发有效的抗肿瘤免疫应答。基于这个认识,运用增强肿瘤抗原的免疫原性的基本方法,诱发机体的抗肿瘤免疫应答,以达到缩小和消除肿瘤的目的。近年来,提高肿瘤抗原的免疫原性的方法很多,如使用免疫佐剂、丝裂原、超抗原等。金葡菌肠毒素(SE)是一种具有高度生物活性的蛋白质,是目前研究较多的细菌性超抗原,无需抗原提呈细胞(APC)加工处理,即可直接与APC膜上的MHC-Ⅱ类分子的抗原结合槽外侧非限定性的结合,以完整的蛋白质分子形式被提呈给T细胞,激活T细胞,激活数量为普通抗原数千倍。SE具有多种免疫学活性,包括刺激大量的T细胞,及活化NK细胞,促进细胞因子大量分泌,诸如:白细胞介素2,干扰素,肿瘤坏死因子,乃至集落刺激因子,是目前已知的人淋巴细胞最强的刺激剂和最有力的细胞因子诱生剂,对肿瘤细胞产生直接和间接的杀伤和抑制作用。目的基于提高肿瘤抗原免疫原性、超抗原的靶向作用,本研究通过体外实验,应用金葡素超抗原联合肿瘤可溶性抗原刺激T淋巴细胞,诱导产生杀瘤性免疫细胞,对肿瘤细胞进行杀伤作用研究,探讨新的治疗肿瘤的免疫疗法。方法1.外周血淋巴细胞的制备:正常献血者外周血,按Ficoll-Hypaque细胞分离液密度梯度离心,吸取淋巴细胞层,PBS混匀,反复洗涤3次,在37℃、5%CO2孵箱中静置60min,收集非粘附细胞,即为外周血淋巴细胞。2.肿瘤可溶性抗原的制备:取处于对数生长期的食管癌Eca109细胞,制成密度为10~7～10~8/ml的细胞悬液,-80℃/37℃条件下反复冻融4次后,5000r/min,离心40min,收取上清即为肿瘤可溶性抗原。考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白含量,0.22μm滤膜过滤, -20℃保存备用。3.SEC,TSA刺激细胞增殖:完全RPMI-1640培养液调整细胞密度为1×10~6/ml,接种于96孔平底培养板,再加入含不同浓度SEA或TSA的等体积的完全RPMI1640培养液,各设3复孔,分别于培养的第24h、48h、72h、96h,用CCK-8比色法测定淋巴细胞的增殖情况。确定SEC/TSA的最佳刺激浓度后,按实验分组:A L;B L+SEC;C L+TSA;D L+SEC+TSA ,分别于培养的第24h、48h、72h、96h,用cck-8比色法测定实验组细胞的增殖情况。4.流式细胞仪分析细胞膜表型:按上述实验分组,完全RPMI-1640培养液调整淋巴细胞浓度为10~6/ml,接种于6孔板,每组4孔,培养第3天,收集细胞样品,每组各孔分别加入FITC标记的CD19/CD3/CD4/CD8,流式细胞仪检测。5.细胞培养上清中TNF-α水平的检测:用完全RPMI-1640培养液调整细胞密度为1×10~6/ml,按实验分组接种于24孔平底培养板,每孔细胞悬液和含SEA(终浓度0.1ng/ml)或TSA(终浓度50μg/ml)的等体积的完全RPMI1640培养液各0.5ml,各设3复孔。分别于培养的第1d、3d、5d,收集各组上清液,按ELISA试剂盒说明书进行检测。6.细胞毒活性检测:分别取食管癌细胞系Eca109和宫颈癌Hela细胞作为靶细胞,单独淋巴细胞组和经食管癌TSA、超抗原SEC联合刺激淋巴细胞组培养诱导的CTLs作为效应细胞,效/靶=20:1,另设单独效应细胞对照组和靶细胞对照组。培养24h后,CCK-8法测各组效应细胞对肿瘤细胞的杀伤率。7.瑞氏染色法检测细胞凋亡:实验分对照组(单纯淋巴细胞),实验组(SEC+TSA刺激的淋巴细胞组),体外培养3日,调各组细胞浓度为1×10~6/ml。收集Eca109细胞(1×10~5/ml),分别与培养3日的对照组、实验组细胞加于已放置盖玻片的六孔板中混合培养24h后,去除悬浮的淋巴细胞和未贴壁的肿瘤细胞,取出带有细胞的盖玻片,进行染色,镜下观察。结果1.不同浓度的SEC/ TSA刺激体外培养的外周血淋巴细胞的增殖能力不同。SEC浓度为0.1ng/ml时外周血淋巴细胞增殖最显著; TSA浓度为50μg/ml时外周血淋巴细胞增殖最显著。在96h内,不同时间点各组体外培养的淋巴细胞增殖能力不同,在24h-72h之间时,每组淋巴细胞增殖能力随时间的增加而增强,各实验组均于72h时细胞增殖最显著(P<0.05)。同一时间点,每组淋巴细胞增殖能力也不同,经食管癌TSA、超抗原SEC联合刺激的D组与A、B、C组比较,细胞增殖活性最高,于72h达到高峰。2.诱导的CTLs细胞表型分析可见:不同刺激条件下细胞培养3日后, 4组CD3均为阳性表达,对照组A的CD8+只有26.31%,而B、C、D三组较之明显升高(P <0.05), D组诱导的CD8+最高,为39.19%,说明所诱导的细胞为CD8+CTL细胞。3.与对照组相比,B,C,D 3组培养上清中TNF-α,1d活性已开始升高,于3d达峰值。其中以SEC联合TSA刺激的D组为最高,与其他两组试验组相比增高显著(P <0.05)。4.经食管癌TSA、超抗原SEC联合刺激的淋巴细胞组诱导的CTLs对靶细胞Eca109杀伤活性为97.36%,显著高于单纯淋巴细胞组63.04%,效应细胞对Eca109的杀伤活性明显高于Hela(P <0.05)。5.瑞氏染色法检测细胞凋亡,两种细胞混合3h时,镜下观察可见大量淋巴细胞黏附在肿瘤细胞周围。经瑞氏染色,光镜下见正常细胞核染成深蓝色或蓝紫色,色泽均一.凋亡细胞可见核固缩,破碎,染色变深,细胞膜皱缩,引发凋亡。结论1.SEC联合TSA诱导淋巴细胞,提高淋巴细胞的活化和增殖能力,诱导的细胞为CD8+CTL细胞。SEC,TSA能够刺激淋巴细胞高水平的分泌TNF-α。2.经食管癌Eca109的TSA作用的效应细胞对靶细胞具有选择性,靶向作用。3.SEC联合TSA诱导活化的CTL能够诱导肿瘤细胞发生凋亡。