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目的:涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)是最常见的涎腺恶性肿瘤之一。因其浸润性强和易发生远处转移而严重危害人类健康,因此探索新的预防治疗方法,提高对涎腺腺样囊性癌的疗效,是广大学者研究的热点问题。多被银莲花(Anemone Raddeana Regel)是毛茛科银莲花属植物的根茎。药理活性研究发现,多被银莲花提取物有抗肿瘤、镇痛、镇静及抗惊厥作用。我们前期的实验结果表明,多被银莲花总皂甙能够抑制人涎腺腺样囊性癌高肺转移细胞(Adenoid cystic carcinoma of high pulmonary metastatic,ACC-M)的增殖,并能够诱导其凋亡。目前Bcl-2家族成员Bcl-2及Bax蛋白在多被银莲花总皂甙诱导ACC-M细胞凋亡的过程中是否起重要作用,尚未见国内外文献报导。本研究拟对体外培养的ACC-M细胞经过多被银莲花总皂甙处理后,通过Western Blot方法,检测Bcl-2和Bax不同时间点的含量,来验证多被银莲花总皂甙诱导ACC-M凋亡过程中Bcl-2家族成员Bcl-2和Bax蛋白的表达及意义,从而为治疗腺样囊性癌植物性化学新药的研究提供实验依据。方法:1材料1.1 ACC-M北京大学口腔医院提供,建立于1995年。1.2多被银莲花总皂甙购买于石家庄乐仁堂药店(产地为黑龙江省),于河北医科大学药学院经溶解与溶剂萃取提纯得到。2实验方法2.1药液制备多被银莲花总皂甙用DMSO溶解制备成20mg/m L储存液,于-20℃冰箱中保存,使用时用DMSO浓度小于0.001%的培养液稀释。2.2细胞培养将10%胎牛血清和链霉素(100ug/m L)、青霉素(100U/m L)放入RPMI1640培养基,置于37℃、5%CO2、湿度饱和的恒温箱内培养,每24~48小时传1代,用0.04%EDTA和0.25%胰蛋白酶(1:1)混合液消化并传代。2.3细胞接种以及药物处理用消化液将处于对数生长期的细胞消化后制成4.0×106个/m L的细胞悬液,再将对照组、24h组、48h组、72h组,共四个培养瓶中分别接种2m L细胞悬液,存放于培养箱。经过24小时细胞贴壁后,再进行药物处理。把20mg/m L的多被银莲花总皂甙储存液稀释成浓度为50ug/m L的溶液,从培养箱中取出贴壁后的细胞,把培养液丢弃,于24h,48h,72h各组中分别加入多被银莲花总皂甙溶液2m L(浓度为50ug/m L),对照组加入二甲基亚砜的RPMI1640培养液2m L(浓度为50ug/m L)。待药物作用24、48、72小时后,提取各组细胞组织蛋白。2.4提取细胞组织蛋白将每一组细胞用PBS洗涤两次,用消化液消化后制成细胞悬液,移入相应EP管中。3000rmp,4℃,15分钟离心。把上清液吸出,留沉淀,这一次用衡盐溶液洗涤吹打,800rmp,离心5分钟,再次把上清液吸出。往各组中分别加入400u L细胞裂解液,并震荡均匀,放在冰上裂解约30分钟。细胞裂解后离心15分钟(4℃,13000rmp),结束后,提取上清液就是细胞蛋白,将细胞蛋白分别装入相应的EP管中,置于-80℃冰箱保存。2.5蛋白的定量本实验在波长为570nm下使用分光光度法测定测定各样本吸光度值。根据标准曲线拟合样品的蛋白浓度。2.6采用western blot检测Bax和Bcl-2的表达经SDS--PAGE(电泳);转膜;封闭;孵育;洗涤;将β-actin条带作为作为对照,奥德赛扫描成像系统的进行各波段灰度值测定,半定量测定。采用统计学软件对结果进行方差分析。3统计分析实验重复三次,收集所得的实验数据,应用统计学方法分析实验结果。结果:Western Blot结果显示:经50ug/m L多被银莲花总皂甙处理后,ACC-M细胞中促凋亡Bax蛋白的表达量随着药物作用时间延长而增加,经灰度值分析Bax蛋白的表达量与对照组相比:24h组的蛋白表达量增加了19.6%(P<0.05),48h组的蛋白表达量增加了35.9%(P<0.05),72h组的蛋白表达量增加了57.2%(P<0.05),差异均有统计学意义。同时,Bcl-2蛋白的表达量随药物作用时间延长降低,经灰度值分析Bcl-2蛋白的表达量与对照组相比:24h组的蛋白表达量降低了21.9%(P<0.05),48h组的蛋白表达量降低了40.0%(P<0.05),72h组蛋白表达量降低了45.2%(P<0.05),均有统计学意义。经统计学分析,随着多被银莲花总皂甙作用时间的延长,Bax/Bcl-2的比值逐渐增大,对照组比值为:0.42±0.009、0.43±0.012、0.43±0.010,无显著性差异(P>0.05);24小时组比值为:0.64±0.009;48小时组比值为:0.97±0.023;72小时组比值为:1.24±0.042,有显著差异(P<0.05)。结论:多被银莲花总皂甙诱导ACC-M细胞凋亡,与其能够通过增加Bax蛋白的表达,同时降低Bcl-2蛋白的表达,导致Bax/Bcl-2蛋白比例增加有关。