在现代奶牛群体改良体系中,种公牛是影响奶牛群体遗传品质的主要因素,而繁殖性状是种公牛生产的重要经济性状,是决定种公牛站经济效益的关键因素。公牛的精液品质性状属于低遗传力的数量性状,受多基因调控,通过常规育种手段选育周期长、效率低,迫切需要新的育种技术和手段。分子育种技术已成为世界生物育种科学的发展潮流,而高繁殖力公牛的定向育种则是奶牛育种产业发展的重要方向。根据国内外组学研究和本实验室的基因芯片前期分析结果,结合基因生理生化功能,本研究确定KATNAL1 和 GSK3α/β基因为公牛精液品质性状相关的候选基因。从启动子、可变剪切、miRNA以及SNP等水平上,探求可用于中国荷斯坦种公牛精液品质性状选育的功能性SNPs,并尝试探讨基于这些功能性SNPs的分子调控机理。主要研究结果分述如下：1.中国荷斯坦公牛KATNAL1基因可变剪切体鉴定与表达分析KATNAL1基因在精子发生过程中发挥着重要作用。采用RT-PCR方法初步鉴定KATNAL1基因的不同可变剪切体,并探索其在成年公牛、小公牛的不同组织中的表达规律,采用RT-qPCR方法测定了不同剪切体以及总mRNA在成年公牛和小公牛睾丸中的表达量。结果显示：除了主转录本KATNAL1 (KATNAL1-TV1)之外,新发现一转录本KATNAL1-TV2(登录号为KF709430),该转录本在基因的第二内含子有68bp保留；生物信息学预测发现,新转录本翻译起始位点退后,可翻译364aa的蛋白,并缺少MIT结构域；RT-PCR结果表明,KATNAL1基因nRNA的表达存在组织差异性, KATNAL1,总转录本(KATNAL1-G)在肝脏、肾脏和睾丸组织中高表达,且成年牛高于小牛组织的表达量；qRT-PCR结果表明,成年牛睾丸中的KATNAL1-G、KATNAL1-TV1 和 KATNAL1-TV2达量分别显著高于小牛睾丸组织对应基因的表达量(P<0.05)；成年公牛睾丸中KATNAL1-TV1的表达量显著高于KATNAL1-TV2表达量(P<0.05),但在小牛睾丸中差异不显著(P>0.05),这表明KATNALl mRNA的表达存在有明显的时间特异性。2.中国荷斯坦公牛KATNAL1基因启动子活性分析与功能SNPs鉴定研究发现KATNAL1-TV2启动子区域和保留的的内含子附近区域各有一SNP c.163-210 T>C (rs 836312085) 和 c.323+6655 T>C (rs135559540);生物信息学预测发现：在KATNAL1-TV2启动子区域由于c.163-210 T>C新出现一个DeltaE结合位点,由于c.323+6655 T>C而使保留的内含子近端增加了SRSF1和SRSF2两个剪切因子的结合位点,而这两种变化都可促进KATNAL1-TV2转录本的形成。通过基因克隆、DNA测序和双荧光素酶基因报告系统等技术构建了不同启动子缺失片段的荧光素酶报告载体,转染MLTC-1细胞,测定双荧光素酶活性,鉴定出KLTNAL1的两个启动子的核心区域,并验证了c.163-210 T>C-C可增强启动子活性；分别用Bi-PASA和RFLP两种方式进行SNP基因分型,关联性分析发现,两个位点的CC型个体在精子畸形率上都显著高于其它两种基因型；单倍型组合关联分析发现,H1H1个体精子活力显著高于H1H4、H2H4、 H3H3、H3H4、H4H4 (P<0.05);单倍型组合H1H1个体的精子畸形率显著低于单倍型组合H1H4、H2H4、H3H4和H4H4(P<0.05)。总之,新发现的2个SNP可以作为中国荷斯坦公牛精液品质性状选育潜在的功能性分子标记。3.中国荷斯坦公牛KATNAL1基因3’UTR SNP对bta-miR-22-5p调控靶基因表达的影响成熟miRNAs可按照两种方式(非完全匹配和完全匹配)与靶基因mRNA的3’端非翻译区(3’UTR)的特定序列结合,造成mRNA翻译抑制或降解。本研究利用RT-PCR和克隆测序技术,在牛KATNAL1 mRNA 3-UTR区域检测到*399A>C SNP位点。利用nicroRNA靶标预测软件分析显示bta-miR-22-5p与KATNAL1基因3-UTR野生型和突变型的结合能力不同；分别将AA和CC两种基因型的3’UTR部分片段连入PMIR-ReportTM Luciferase报告载体中,和bta-miR-22-5p真核表达载体共转染MLTC-1细胞,通过双荧光素报告系统检测发现*399 A>C显著降低了与KATNAL1基因3-UTR的结合能力(P<0.05)；RT-qPCR结果显示AA基因型个体KATNAL1基因表达量显著低于AC和CC两种基因型个体(P<0.05)。但是,与之相悖的是,SNP*399 A>C通过关联分析与精液品质性状无关联性。因此,需要进一步研究niRNA的调控机制,并选择更大样本群进行关联分析,以确定该SNP位点能否作为中国荷斯坦公牛精液品质性状选育潜在的功能性分子标记。4.中国荷斯坦公牛GSK3β基因可变剪切体鉴定与基因表达分析可变剪切可以改变基因编码区组成,产生不同的蛋白质,改变基因功能。为初步探索GSK3β基因转录本在公牛睾丸中的表达规律,利用RT-PCR扩增出了含有完整编码框的牛GSK3β的部分cDNA序列,新发现三种可变剪切体,分别命名为(GSK3β2 (E11b保留)、GSK3β3 (E11缺失)和GSK3β4(E9缺失);利用RT-qPCR技术对GSK3β进行定量分析,发现GSK3β基因的表达在小公牛和成年公牛中存在组织差异性和时间表达特异性,而且GSK3β4在睾丸中是主转录本；通过生物信息学分析,GSK3β基因不同物种间具有高度的同源性和相似的潜在功能,四种转录本C端有差异。这为进一步研究不同转录本在精子发生过程中的作用奠定了一定的基础。5. Pre-miR-320b序列中SNP G12A通过靶向调控GSK3β与中国荷斯坦公牛的鲜精密度存在关联miRNA基因SNP可能影响miRNA的表达水平,导致靶向调控能力的变化,最终造成生物体性状的变化。本研究证实在Pre-miR-320b上存在一个SNP G12A (rs43416688),通过基因分型和关联性分析,发现G12A-AA基因型个体在鲜精密度上显著高于GA基因型个体(P<0.05)；通过多个生物信息学软件预测发现GSK3β基因可能是bta-miR-320b的靶基因；利用mimics. inhibitor、 pre-miR-320b-G、pre-miR-320b-A 和 PMIR-GSK3p-3’UTR克隆表达载体按照不同组合共转染MLTC-1细胞,测定双荧光素酶活性分析发现GSK3β基因是bta-miR-320b的靶基因,而且SNP的等位基因A对于bta-miR-320b的成熟是不利的；通过颈环法RT-qPCR试验检测miRNA的表达发现,mimics 和 inhibitor可以在细胞水平上作为bta-miR-320b的模拟物和抑制剂进行过表达或者抑制表达的研究,而且pre-miR-320b-G加工为成熟的bta-miR-320b 和 pre-miR-320b-A的效率高(P<0.05)；另外,在睾丸组织中,AA基因型成年公牛和小公牛的bta-miR-320b表达要显著低于相对应个体的GA基因型(P<0.05),小牛bta-miR-320b表达显著高于成年表达量(P<0.05),说明pre-miR-320b-GA在体内加工要比pre-miR-320b-AA高效,同时也说明bta-miR-320b的表达有时间差异性；利用RT-qPCR试验检测靶基因GSK3β的表达发现,AA基因型成年公牛和小公牛睾丸中的GSK3β mRNA水平上的表达要显著高于相对应的GA基因型(P<0.05),成年公牛睾丸中GSK3β的表达量要显著高于小公牛(P<0.05)说明睾丸中miR-320b 和GSK3β基因的表达既受G12A的影响,又有时间表达差异性。因此,我们推测SNP G12A对精液品质性状的影响可能由bta-miR-320b通过靶向调控GSK3β的表达来实现。6.中国荷斯坦公牛GSK3α基因核心启动子的分析和功能性SNPs的鉴定启动子作为基因必不可少的元件可以影响基因转录的起始和表达的强度,而基因编码区和内含子上的SNPs可通过不同方式影响基因的表达和功能。本研究利用生物信息学方法预测基因的启动子区,并通过构建不同启动子缺失片段的荧光素酶报告载体,经转染和双荧光素酶活性测定,确定了GSK3α基因的核心启动子区和负调控区域；生物信息学预测发现负调控区域存在c-MYC、USF和YY1等负调控元件,而且GSK3α基因启动子处在一个CpG岛中；不同活力来源精子的GSK3α基因负调控区域DMR甲基化试验表明GSK3α基因启动子都是低甲基化,而且,在负调控元件GATA的CpG位点上,低精子活力个体精子GSK3α甲基化水平显著高于高精子活力个体(P<0.05)；全基因SNP筛选发现g.+4321 A>G和g.+7207 A>G两个SNPs,分别位于第四内含子和第八外显子上,后者为同义突变。经分型和关联分析发现,g.+4321 A>G的3种基因型对精液品质性状无显著影响(P>0.05),g.+7207 A>G-GG基因型个体鲜精活力和冻后活力显著高于AA型个体(P<0.05),单倍型组合H2H2、H2H4和H4H4个体鲜精活力和冻后活力都显著高于其它单倍型组合个体(P<0.05)。因此我们推测GSK3α基因可以通过启动子甲基化差异和功能性SNPs来影响表达和功能,最终影响公牛的精子活力。