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糖组分及含量是决定苹果果实品质的重要指标。果糖(Fru)作为甜度最高的可溶性糖,在苹果果实中约占总糖含量的50%,对果实甜味起着决定性作用。本文以‘蜜脆(HC,Honeycrisp,高果糖品种)’ב秦冠(QG,Qinguan,低果糖品种)’杂交群体为材料,结合高密度遗传连锁图谱,对糖含量性状进行数量性状位点(QTL)定位,以筛选果糖含量遗传控制的关键基因和分子标记。此外,还对苹果果实己糖转运蛋白Md HT2.2在糖积累中的功能进行了分析。旨在探究果糖含量的遗传控制与果糖积累的调控机制,为糖含量品质改良与遗传育种提供新见解与理论依据。本文主要研究结果如下:1.苹果果实糖含量的QTL定位及果糖含量遗传调控基因的筛选与功能分析。1.1苹果果实糖含量的QTL定位。以‘蜜脆’ב秦冠’杂交群体为材料,连续两年对果实的可溶性固形物(SSC)、果糖、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、山梨醇(Sor)、蔗糖(Suc)和总可溶性糖(TSS)含量进行分析,结果表明,两年中各类糖含量均表现出连续分布趋势。2015年中,SSC为8.3-17.4%Brix,Fru、Glc、Gal、Sor、Suc和TSS含量分别为28.26-65.92,16.36-76.65,2.02-9.02,0.49-15.63,2.61-48.82和86.83-172.54 mg/g FW。2016年中,SSC为10.7-19.4%Brix,Fru、Glc、Gal、Sor、Suc和TSS含量分别为39.00-80.82,12.33-77.45,1.24-8.40,1.27-15.20,5.00-51.96和107.91-194.88 mg/g FW。通过糖含量之间的相关性分析发现,SSC与Suc、SSC与Sor、Glc与Gal、Sor与Suc均呈显著正相关,而Glc与Suc、Gal与Suc均呈负相关。通过对糖含量性状QTL定位分析发现,连续两年稳定定位的QTL重叠区段中,SSC分布在‘QG’的LGs 01、09和17上;Glc含量分布在‘HC’的LG 01和‘QG’的LG 16上;Suc含量分布在‘HC’的LG 01上;Fru含量分布在‘HC’的LGs 01和03上,其中LG 01上的重叠区间QTL-Fru-LG01对果糖含量贡献率最高。1.2 QTL-Fru-LG 01区间内苹果果实果糖含量遗传控制基因的筛选与功能分析。根据基因组信息分析发现该位点内包含了315个基因,其中有22个与糖代谢、转运或转录调控相关的基因,特别是包含了7个串联重复的山梨醇脱氢酶(Md SDH)基因。经RNA-seq和q RT-PCR分析发现,Md SDH2表达在‘HC’果实发育后期升高,而在‘QG’中变化不显著,这与‘HC’和‘QG’果实生长发育过程中SDH酶活性及果糖含量变化模式的差异相一致。而‘HC’和‘QG’中Md SDH2编码序列一致。通过克隆‘HC’的Md SDH2基因并在苹果果肉愈伤中过表达发现,SDH酶活性增加了30%左右,果糖含量增加了20%左右,山梨醇含量降低了20%左右,而沉默株系果糖含量降低,山梨醇含量升高。这些结果表明,‘HC’LG 01上果糖含量定位QTL区域中Md SDH2表达的差异具有调控果实果糖含量的功能。1.3为探明‘HC’和‘QG’中Md SDH2基因在果实成熟阶段表达存在差异的原因,本文分别克隆了‘HC’和‘QG’中Md SDH2启动子的4个单倍型。通过序列比对分析发现,HC-Md SDH2启动子区存在着13个SNP位点,经顺式作用元件预测分析发现,在这13个SNP位点中含有6个可能的转录因子结合位点,其中仅在‘HC’中存在的Md SDH2基因起始密码子ATG上游491bp处SNP位点SDH2p-491(A/G)的变异可能影响脱落酸(ABA)信号通路相关ABA不敏感型(ABI3)转录因子的结合。经EMSA、Dual-luciferase、CHIP-q PCR等技术分析表明,Md ABI3能与HC-Md SDH2启动子上SDH2p-491(A/G)位点处为A的单倍型结合,增强其转录,而与G的单倍型启动子和QG-Md SDH2单倍型启动子结合能力较弱。Md ABI3在‘HC’中的瞬时过表达能显著提高Md SDH2表达,增加果糖含量,而在‘QG’中Md ABI3的过表达对Md SDH2转录水平和果糖含量影响较小。同时,外源施加ABA可显著诱导Md ABI3表达,并显著上调启动子SDH2p-491(A/G)位点的‘HC’及杂交后代Md SDH2的表达,而对启动子SDH2p-491(G)位点的‘QG’及杂交后代中Md SDH2影响较小,这与二者果实发育过程中ABA的含量及Md ABI3和Md SDH2的表达模式一致。这些结果表明,Md SDH2启动子SDH2p-491(A/G)位点的变异,影响了ABA诱导型转录因子Md ABI3的结合能力,调控着果实发育后期Md SDH2的表达,影响果糖的含量。此外,对杂交后代和栽培品种中该SNP位点不同基因型与其Md SDH2表达量、SDH酶活性和果糖含量的关系分析发现,该SNP位点可作为一个果糖含量相关分子标记应用于分子辅助选择育种。2.苹果己糖转运蛋白Md HT2.2在果糖含量调控中的功能分析。通过系统发育进化分析、跨膜结构预测、时空表达特性分析、亚细胞定位和酵母功能互补实验发现,Md HT2.2定位于细胞质膜上,是一种在果实成熟期的薄壁细胞中高度表达的己糖/H~+同向转运蛋白,且对果糖和葡萄糖有高转运活性。在番茄中,Md HT2.2异源表达的转基因株系成熟叶片中己糖含量低于野生型而蔗糖高于野生型,幼果期己糖含量无明显差异,而转基因株系蔗糖含量显著增加。成熟果实中SSC、果糖和葡萄糖含量显著增加,但蔗糖含量降低。通过糖代谢相关酶活性及基因表达水平分析发现,转基因番茄成熟果实中细胞壁酸性转化酶(CWINV)活性与其编码基因Sl LIN5表达量显著增加可能与蔗糖含量的降低相关。在Md HT2.2过表达植株中,利用CRISPR-Cas9技术突变sllin5后,CWINV活性降低,由Md HT2.2过表达引起的糖含量改变得到了恢复。这些结果表明,己糖转运蛋白可通过调控质外体己糖信号来调控CWINV表达及活性,进而影响蔗糖运输分配和果实糖含量。并且在不同组织及发育时期,糖代谢以及糖信号存在很大差异。