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背景糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）是糖尿病人最常见的并发症之一,也是工作年龄阶段（20至65岁）人群致盲的主要病因,且病变通常是不可逆的。DR是一类由于视网膜长期功能和结构损伤引起的渐行性疾病,其病理过程涉及视网膜细胞生化与代谢异常的复杂相互作用,主要的病理机制包括细胞凋亡、氧化应激、炎性反应和血管基底膜的改变。临床上DR可分为早期非增殖型与晚期增殖型。早期非增殖型组织病变的主要表现是:视网膜血管选择性的周细胞缺失（pericyte loss,PL）,无细胞毛细血管（accellur capillary,AC）的生成,基底膜（basement membrane,BM）增厚,血管密度的降低,内核层与外网层出血,以及外网层嗜酸性渗出物的增加。晚期增殖型病变的主要特征是:视网膜血管新生和玻璃体出血。目前DR主要治疗策略仍是通过药物手段抑制血管新生,但由于视网膜已经发生不可逆性病变导致疗效不理想,因此迫切需要对DR进行早期的诊断与干预。肌浆网内质网钙ATP酶（sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase,SERCA）能利用ATP水解提供的自由能将细胞质Ca2+主动转运至肌浆网与内质网中,是一类维持细胞内的Ca2+稳态的膜转运蛋白。SERCA普遍存在于真核细胞肌浆网和内质网中,通过维持较低的胞质内Ca2+浓度保证多种生理调节与信号转导的正常运行。细胞内较高浓度的Ca2+可以通过激活下游通路引起血管细胞的凋亡以及内皮钙粘蛋白（vascular endothelial-cadherin,VE-cad）/连环蛋白复合物紧密连接的重排,进而破坏内皮细胞的屏障功能,导致血管通透性的改变与血管新生。SERCA2是血管中SERCA的主要亚型,主要包括SERCA2a和SERCA2b两种基因型,其674位半胱氨酸（cysteine 674,C674）是一关键的氧化还原位点。C674中巯基（C674-SH）的谷胱甘肽化能够增加SERCA2的活性,从而通过调控Ca2+参与细胞的生理活动。在糖尿病、动脉粥样硬化等血管疾病的动物模型以及患者主动脉中均发现SERCA2中C674-SH发生了显著的不可逆性氧化（C674-SO3H）,干扰了该位点的谷胱甘肽化调控。目前有关SERCA2及其C674位点在微血管系统的生理病理调控机制仍然不甚明确。我们推测在病理条件下SERCA2中C674的不可逆氧化引起的C674谷胱甘肽化位点的失活参与了视网膜病变的形成。为了明确SERCA2中C674这一氧化还原位点的失活是否直接导致视网膜病变,我们利用C57BL/6J背景下构建的SERCA2中C674S基因敲入（SERCA2 C674S knock-in）小鼠,也就是在674位点用丝氨酸（serine,S）取代了半胱氨酸（C674→S674）,来模拟病理情况下C674的不可逆氧化导致的这一氧化还原位点的失活。由于纯合子胎儿在血管发育初期（8-10 d）就于子宫内死亡,因此所有实验都是在杂合子SKI（C674/S674）小鼠和同窝的对照野生（wild type,WT,C674/C674）小鼠上进行的。方法（1）检测I型糖尿病小鼠视网膜血管中SERCA2的C674不可逆氧化程度。（2）检测视网膜中SERCA2各亚型的丰度及各亚型在WT小鼠与SKI小鼠的表达差异。（3）检测SKI小鼠视网膜血管中AC与PL的生成、组织结构和血管密度等变化情况。（4）检测SKI小鼠与视网膜基底膜改变、细胞凋亡、内质网应激、氧化应激等相关蛋白的表达情况。（5）检测人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）中过表达SERCA2 C674S重组腺病毒对ROS生成及细胞凋亡相关蛋白表达的影响。结果（1）I型糖尿病小鼠出现明显的视网膜血管的生成,并伴有视网膜血管明显的C674不可逆氧化。（2）在小鼠视网膜中SERCA2b的丰度远远大于SERCA2a;与WT小鼠相比,SKI小鼠的SERCA2表达有下降趋势。（3）相较于WT小鼠,SKI小鼠出现类似于I型糖尿病小鼠的视网膜病变,有明显的视网膜血管PL和AC的生成。（4）相较于WT小鼠,SKI小鼠视网膜:1)组织学方面,各层厚度无明显变化;视网膜血管枝点、血管环数、血管密度有下降趋势,IB4染色显示血管数显著降低;2)钙离子调控方面,钙依赖性蛋白电压依赖性阴离子通道1（voltage-dependent anion channel 1,VDAC1）及其二聚体表达显著升高,钙调神经磷酸酶（calcineurin,CaN）的活性显著升高;3)视网膜组织中活性氧（reactive oxygen species,ROS）显著增加;4)内质网应激方面,各相关蛋白标志物表达无明显差异;5)BM增厚方面,IV型胶原（collagen IV,Col IV）、基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2,MMP2）、纤维粘连蛋白-1（fibronectin-1）在mRNA水平上显著升高,Col IV、MMP2、转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）、赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase,LOX）在蛋白水平表达显著上升;6)血管内皮屏障功能方面,闭锁小带蛋白-1（zonula occludens-1,ZO-1）在mRNA水平和间隙连接蛋43（connexin43,Cx43）在蛋白水平上均有降低趋势;VE-cad表达显著下降,而其上游调节的关键酶可溶性环氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolase,sEH）表达显著升高;7)细胞存活与凋亡方面,丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine kinase,Akt）中473位点与内皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）中1176位点磷酸化水平显著降低;过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPAR-γ）表达显著降低,核转录因子（nuclear factor kappa B,NF-κB）磷酸化水平显著升高,抗凋亡因子B细胞淋巴瘤因子xL（B-cell lymphoma-extra large,Bcl-xL）显著下降,促凋亡因子B细胞淋巴瘤因子2相关死亡启动子（B-cell lymphoma-2-associated death promoter,Bad）、B细胞淋巴瘤因子2相关X蛋白（B-cell lymphoma-2-associated X,Bax）、半胱天冬酶3剪切体（cleaved-caspase3）显著上升。（5）在HUVEC中,相较于感染空载体腺病毒,过表达SERCA2b C674S重组腺病毒:1)ROS的生成显著增加;2)PPAR-γ的表达显著下降;3)钙依赖性蛋白VDAC1、促凋亡蛋白标志物Bad与cleaved-caspase3的表达显著升高。结论本课题研究结果表明,1)SERCA2中C674的失活可直接导致小鼠视网膜AC的生成、PL的发生以及血管密度的减少;2)SKI小鼠具备早期非增殖型DR特征,有望成为新的动物模型;3)病理情况下SERCA2中C674的不可逆氧化,可能通过破坏胞内钙稳态激活凋亡信号通路,促进视网膜病变的发生。