腺病毒(Adenovirus, Adv)感染在全球范围内广泛流行,具有传染性强,宿主范围广的特点。腺病毒不仅是呼吸道感染、结膜感染和肠道感染较为常见的病原体之一,它们还可能引起无菌性脑膜炎、心肌炎、脑炎和肝炎等。对于移植手术患者、HIV感染者等免疫功能低下的人群,腺病毒更是常见感染因素之一。因此,对于腺病毒感染的预防、诊断和治疗一直都是国内外学者关注的热点之一人类腺病毒属于腺病毒科(Adenoviridae)的哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)。人类腺病毒根据不同的免疫学、生物和生化特性分为7个亚群(A至G),至今国际病毒分类委员会(ICTV)已经公布57种血清型。在2011年,有科学家报道发现了58型腺病毒,但还未通过ICTV的鉴定。不同血清型的腺病毒宿主嗜性不同,因此表现出不同的临床症状。B组的3型和7型腺病毒以及E组的4型腺病毒是呼吸道感染的常见病毒,常引起下呼吸道感染症状如发热,咳嗽和肺炎等,以及在夏季引起咽结膜性发热的爆发感染。国内在2004-2005年间多地区暴发了3型腺病毒感染,流行范围包括江苏、北京、湖北等地；广州在2004年也报道了一起幼儿园咽结膜性发热感染；山西省2009年暴发了一起7型腺病毒感染,该病毒引起婴儿严重下呼吸道症状；2008-2009年,3型腺病毒在加拿大NewBrunswick省暴发流行,几百人被感染,甚至有3名病人死亡；在美国新兵训练营和老年看护机构都报道有4型腺病毒的感染。目前,腺病毒感染和其他病毒性感染疾病一样,没有特效药物及疗效显著的治疗方法,主要依靠机体自身免疫系统的抵抗反应,消灭病毒而痊愈。先前的研究已表明,机体产生的腺病毒抗体对同型腺病毒具有长久而稳定的保护性。因此,开发高效、安全低价的腺病毒疫苗是预防腺病毒感染的有效方法。70年代初,美国军队曾在新兵训练时期使用Adv4-Adv7口服疫苗,使腺病毒相关的呼吸道疾病得到了有效的遏制。1999年,疫苗停止供应后,新兵训练中心监测发现呼吸道感染率明显上升。直到2011年经FDA批准启用新的Adv4-Adv7口服疫苗,再次有效降低了呼吸道感染疾病的发生。但由于口服活疫苗经粪便排出后仍具有传染的可能性；同时服用两种或以上不同亚型的腺病毒疫苗可能进行同源重组而产生新型病毒,带来新的感染风险,故国外只限于军队中使用。除此之外,国内外关于腺病毒的疫苗研究及临床应用都还在基础研究阶段。虽然腺病毒的疫苗研究还在起步,但是以腺病毒为载体的基因工程疫苗已经被广泛研究。腺病毒载体和其他病毒载体相比,具有以下优点：病毒结构和功能背景清楚；可以携带10kb以内的外源基因；感染范围广；结构稳定,不整合到宿主细胞基因组也不易发生突变等。最新的数据表明全球约有1/4的基因治疗和疫苗载体的临床试验应用了Adv2和Adv5载体。但是强烈的宿主排斥反应一直是腺病毒载体在临床上应用的阻碍,而且,近期有学者发现,因为腺病毒受体CAR在许多肿瘤细胞表面并不表达,导致病毒载体无法吸附细胞,对CAR受体依赖的2型和5型腺病毒载体可能并不适合肿瘤治疗使用。人3型腺病毒的受体作用机制虽仍未清楚,但目前研究表明大部分肿瘤细胞表面都有其受体的表达,因而Adv3将可能作为肿瘤治疗的新型载体候选,也有些学者已经在进行4型,35型等其他血清型腺病毒载体相关的研究。本课题组自2007年开始腺病毒疫苗的研发工作,至今,我们的研究团队已经围绕腺病毒基因工程疫苗的研制做了大量相关研究,并取得阶段性进展。目前,我们已经成功构建了非复制型基因工程Adv3；置换Adv3和Adv7的六邻体区域构建新的重组腺病毒,并鉴定其免疫原性也发生了改变；对3型和7型腺病毒中和表位的进行了预测和鉴定,置换Adv3和Adv7上中和表位,构建新的嵌合病毒,研究证明其在动物实验中可同时诱导抗人3型和7型腺病毒中和抗体；以3型腺病毒为载体,成功构建了带有肠道病毒EV71中和表位的重组3型腺病毒等,其可能为同时抗EV71和Adv3的双价疫苗。本课题组在腺病毒疫苗研究中取得的成果都已经发表,然而,当疫苗应用于临床,则需要了解目标人群中Adv中和抗体的预存情况,清楚了解普通人群血清中是否存在中和抗体,中和抗体阳性率以及其分布特点,这些结果将指导我们选择合适的免疫人群及最佳免疫时间,对疫苗的开发及使用具有指导意义。因此,本研究的第一部分主要对广州健康人群体内3型,4型和7型腺病毒中和抗体水平进行了检测和分析,了解腺病毒中和抗体分布特点及变化。本研究的第二部分则是在课题组前期对Adv3中和表位的预测及研究基础上,通过制备和筛选Adv3的中和性单克隆抗体,以此为媒介,对3型腺病毒的中和表位进行鉴定研究。通过体外中和抗体和中和表位的特异性结合,确认预测中和表位的有效序列。第一章普通人群血清中腺病毒的中和抗体分析本实验收集了2008年广州市儿童医院职工体检血清标本、广州银行医院体检血清标本和门诊非呼吸道患儿血清标本共452份,通过微孔板血清中和试验检测3型,4型和7型腺病毒中和抗体水平。将标本按照年龄共分为7个组：0-6m组,7-12m组,1-3y组,3-7y组,7-20y组,20-40y组合40-60y组。先进行病毒滴度测定和血清效价预实验,确定微孔板血清中和试验的病毒工作浓度是100TCID50,血清的稀释比例是1：8。然后开始进行血清标本的中和试验,当阳性对照、正常细胞对照,血清毒性对照全部成立时,进行判定结果判定,以被检血清孔出现100%CPE判为阴性,50%以上细胞出现保护者为阳性。采用SPSS20.0软件分析数据,通过R×C资料卡方检验,普通人群腺病毒中和抗体平均分布具有统计学差异,P<0.05。从7-20y组开始,腺病毒中和抗体阳性率显著上升。除了0-6m组人群,3型,4型和7型腺病毒中和抗体阳性率都随年龄增加而增高。3型腺病毒中和抗体率最低的是6-12m组和1-3y组,之后,随年龄增加,在20-40y组人群中和抗体阳性率已经达到78%,在40-60y组中和抗体阳性率也稳定在78%；4型腺病毒中和抗体率最低是在6-12m组,随年龄增加而升高,在7-20y组人群中和抗体阳性率达到60%,20-40y组人群中和抗体阳性率保持稳定,但在40-60y组人群中和抗体阳性率又开始上升至82%；7型腺病毒中和抗体率最低的是1-3y组,阳性率仅5%,之后随年龄增加而上升,直到40-60y组人群中和抗体阳性率高达76%。研究结果充分显示了人群中和抗体水平的年龄依赖性,而且不同血清型的腺病毒中和抗体水平分布也有所不同。对0-1y婴幼儿腺病毒中和抗体水平进行分析,结果发现0-1m婴儿群体的3型腺病毒中和抗体阳性率最高,达到58%,之后开始下降,到3-6m年龄组的时阳性率最低,阳性率为13%,之后开始缓慢上升。7型腺病毒中和抗体水平变化趋势和3型腺病毒相同,但是每组的阳性率都要低于3型腺病毒中和抗体水平,尤其是3-6m组,阳性中和抗体率为0。根据卡方分析,Adv3组x2=16.979,P<0.05,结果具有统计学差异,Adv7的P<0.05,其抗体水平变化也有差异,而Adv4组P>0.05,抗体变化无统计学差异。而4型腺病毒中和抗体阳性率变化和以上两组都不同,它也是0-1m组最高,但其他3个年龄组变化不大,都维持在10-13%之间,可能和其感染方式及流行特点有关。该组分析显示母体抗体对0-6m婴儿具有保护作用。不同血清型腺病毒感染后会诱发型特异型的中和抗体,因此,在人体内可能会同时存在不同型的腺病毒中和抗体,我们对人群中不同型腺病毒中和抗体混合存在的情况进行分析,结果显示：3种血清型病毒的中和抗体都不存在的人数比例在6-12m组和1-3y组最高,都有70%以上,之后,随年龄增大而比例下降,尤其是从3-7y组到7-20y组,比例急剧下降,从54%降至9%,而到40-60y组人群,抗体阳性比例为0,即检测人群中任何人都可能已经携带了1种或多种腺病毒中和抗体；只携带一种腺病毒中和抗体的人群比例最高的是0-6m组和7-20y组,0-6m组人群抗体阳性率为45%,7-20y组人群抗体阳性率为37%。携带两种和三种腺病毒中和抗体人群比例则是随年龄增加而增加,40-60y年龄组人群中,他们的中和抗体阳性率分别是42%和46%。这组研究揭示,每个人在一生中都可能遭遇一次或者多次的腺病毒感染,腺病毒疫苗的使用可能减少每个人被腺病毒感染的几率。对不同环境中人群的腺病毒中和抗体水平进行分析,从数据来看,医护职工不同型别的腺病毒中和抗体阳性率都要稍高于普通人群,但通过卡方检验,三种腺病毒中和抗体的阳性率分别统计,他们的P>0.05,说明不同腺病毒的两种人群检测结果都无显著性差异。本章从不同角度对人群腺病毒中和抗体阳性水平进行了分析和比较,结果发现腺病毒中和抗体的阳性率有明显的年龄依赖性,随着年龄增长,抗体携带阳性率也增高,6m-3y之间,不同型腺病毒的中和抗体阳性率都偏低,这段时间不但是腺病毒的易感时期,也可能是接种腺病毒疫苗的最佳时期。而且不同血清型的腺病毒中和抗体的流行分布也有不同,3型和7型腺病毒的流行趋势较为接近,而4型腺病毒散发性更为明显。腺病毒感染在人群中普遍存在,40-60y人群抗体携带的数据显示,每个人都可能携带一种或多种腺病毒中和抗体。本次研究的结果将为腺病毒疫苗的开发及腺病毒基因工程载体的研究都有一定的促进作用。第二章3型腺病毒单克隆抗体的制备和初步鉴定本实验将增殖的3型腺病毒用蔗糖梯度密度离心方法进行纯化,然后免疫BALB/c小鼠,通过PEG使小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合,并使用HAT选择性培养基筛选融合细胞,用间接ELISA方法测定单克隆抗体的效价,结果获得1株能稳定传代的杂交瘤细胞株1B6。然后对获得的单克隆抗体1B6进行免疫球蛋白亚型,1B6MAb鉴定IgG1亚型,轻链为K链。然后制备腹水,最后用饱和硫酸铵-辛酸沉淀法对单克隆抗体腹水进行纯化,获得高效价的1B6MAb。根据ELISA和Western blotting结果显示,1B6MAb与Adv3病毒粒子和原核表达的六邻体蛋白有良好的反应性和特异性,同时也证明1B6MAb可以识别六邻体的线性表位。并且通过细胞免疫化学法检测,也能直观看出1B6抗体只和Adv3腺病毒感染的细胞有高度特异反应性的结合,1B6MAb对病毒蛋白表位的天然状态也能识别,都具有反应性,而且抗体灵敏度高,效价能达到105以上。通过本次实验,我们获得了一株能够稳定传代的杂交瘤细胞株,1B6MAb既能识别原核表达的六邻体蛋白,也能识别天然病毒,很可能是一株针对六邻体蛋白线性表位的多肽,而这个表位是否具有中和作用,还需要进一步证实。第三章单克隆抗体1B6对3型腺病毒中和表位的鉴定和分析首先,复苏并增殖Ad3EGF和A7HAd3egf两株基因工程构建病毒,Ad3EGF病毒载体是将EGFP蛋白转导进病毒载体,使其带有EGFP标记,易于被检测。而A7HAd3egf病毒则是前期同事将7型腺病毒的六邻体蛋白取代3型腺病毒的六邻体蛋白而形成的基因工程构建病毒,该病毒已经被从分子和免疫学角度证实其合成表达的六邻体蛋白确实是7型腺病毒六邻体蛋白。我们将1B6MAb与这两株带有绿色荧光蛋白的基因工程构建病毒孵育后,进行体外中和试验,通过荧光测定法,检测抗体和病毒中和后,细胞受感染的情况。采用SPSS两独立样本t检验分析,每组t检验比较的P<0.05,即每组数据都有显著差异,即表明和对照试验相比,Ad3EGF病毒感染能被1B6抗体保护。从荧光检测的结果来看,在1：64抗体稀释作用的时候,病毒的复制未受到影响,Ad3EGF和A7HAd3egf病毒荧光检测相对比值都在70%以上,而A7HAd3egf荧光值更是高达99%。而之后,抗体稀释到1：32时,Ad3EGF的复制开始受到1B6抗体的抑制,荧光值下降到40%,在1：8抗体稀释度时候,相对荧光值已经在小于20%,病毒复制明显被抑制,Ad3EGF荧光值随抗体滴度的增加而明显下降。而病毒A7HAd3egf荧光值则一直稳定在80-100%之间,它的复制几乎未受到抗体中和作用限制。中和试验的结果可以明显看出,1B6抗体具有中和作用,而且特异针对3型腺病毒的六邻体蛋白。然后,我们通过比对同源性较高的Adv3-gz01和Adv7-gz8腺病毒的六邻体氨基酸序列,选择了6个变异区段进行原核表达。间接ELISA结果可以看出,1B6MAb对R7和R7s都具有高特异性,但是R7s的特异性比R7稍低,而对其他变异区肽段都呈阴性反应。推测可能R7s缺少了几个氨基酸残基,从而亲和力比R7弱,但这个推测还有待进一步的实验证实。为了对鉴定的表位进行确证,我们又设计了竞争抑制实验。ELISA实验采用3×4析因分析结果,三因素的P<0.05,说明稀释浓度和竞争抗原不同,所检测的OD值都有差异,而且稀释浓度和竞争抗原两因素间存在交互作用,即蛋白浓度的高低也影响了其竞争能力的高低。R7片段上的表位可以完全封闭MAb1B6的对位,令单克隆抗体失去对全长衣壳蛋白的识别能力,R7s片段封闭功能较弱,只能部分封闭单克隆抗体的对位,而作为对照的R1蛋白,没有封闭能力。最后,我们还把本课题组之前构造的各种腺病毒基因工程载体,都与MAb1B6抗体进行了特异性验证,结果发现,只要是含有3型腺病毒六邻体R7序列的重组病毒都能够被识别,而其他R7序列突变的六邻体蛋白的重组腺病毒则不能被识别。该实验不但再次证实了MAb1B6对3型腺病毒六邻体蛋白的特异性。而且,由于这些腺病毒基因工程载体都保持了表位的天然结构,再次证明1B6抗体可以识别天然表位,也能识别线性表位,而我们所鉴定的R7表位应该是一个连续性的线性的天然表位。本章不但通过中和试验验证了1B6MAb对3型腺病毒六邻体的中和作用,而且能专一识别六邻体上R7表位,也通过竞争ELISA试验等证实了六邻体上R7表位是一个连续性线性的天然表位。结论一、本课题对普通人群血清中腺病毒中和抗体水平从不同角度进行了分析。结果表明,成年人群血清中70%以上都带有一种以上腺病毒中和抗体,尤其是40-60y年龄组,人群中和抗体阳性率为100%。6m以前的婴儿,50%以上都受到母体抗体的保护,而6m-3y年龄组人群抗体阳性率最低,他们是腺病毒感染的易感人群,而该年龄段也是疫苗接种的最佳时期。二、本课题获得了一株能高特异性、高灵敏性的能识别连续的线性的天然表位的中和性单克隆抗体。三、3型腺病毒六邻体的R7多肽被鉴定是一个中和表位,抗原部位能被1B6单克隆抗体封闭。