乳腺癌细胞的增殖过程受细胞间的紧密连接(Tight Junctions,TJs)调节。TJs通过不同的分子机制影响上皮细胞增殖能力。Claudins(CLDNs)是TJs的主要成分,具有4个跨膜区,并含有一个PDZ结构域的羧基末端,通过该结构域与多种同样含有PDZ结构域的信号蛋白结合,参与信号通路调节,其中包括与细胞增殖分化相关的ERK信号通路,ERK信号通路作用于下游蛋白,如cyclin D1,影响细胞增殖能力。然而,CLDNs如何通过ERK信号通路靶向下游蛋白进而调控细胞增殖的具体作用机制尚不清楚。本课题组前期工作结果表明,在乳腺癌细胞中CLDN6表达下调,过表达CLDN6抑制细胞的增殖能力。根据高通量基因测序结果显示,过表达CLDN6,cyclin D1的表达下调。本课题通过预实验验证,在乳腺癌细胞中过表达CLDN6,cyclin D1表达下调,与测序结果一致。由此我们认为,CLDN6抑制乳腺癌细胞的增殖能力可能与抑制cyclin D1的表达相关。Cyclin D1是细胞周期蛋白中的一种,其启动子区含有多种转录因子的结合位点,其中包括转录因子Sp1,Sp1与cyclin D1启动子区的结合位点结合后,可以促进cyclin D1的转录水平,进而调控细胞的增殖能力。Sp1属于Sp/KLF锌指家族,是人体细胞中重要的转录调控因子,作为主要的GC盒转录因子参与调控靶基因的表达。Sp1靶向调控多种蛋白,同时也受很多蛋白和信号通路的调控,包括ERK信号通路。有研究显示,ERK信号通路激活后,Sp1表达上调。ERK-Sp1信号通路在很多肿瘤生长增殖过程中发挥作用。课题组前期工作中发现,在宫颈癌细胞中,CLDN6通过PDZ结构域与AF6结合,抑制了AF6与Ras的结合,竞争性地抑制了Ras和Raf的结合,进而抑制ERK信号通路的激活。由此我们推测:CLDN6可能通过ERK-Sp1信号通路下调cyclin D1的表达,抑制乳腺癌细胞的增殖能力。目的:探讨CLDN6通过ERK-Sp1信号通路下调cyclin D1表达抑制乳腺癌细胞增殖能力的作用机制,为靶向CLDN6的乳腺癌治疗提供实验依据。方法:以前期工作中所获得的稳定过表达CLDN6基因的人乳腺癌细胞系MCF-7及MDA-MB-231(克隆组);转染空载pc DNA3.1质粒的MCF-7及MDA-MB-231细胞(空载组)为研究对象:RT-PCR和Western-Blot法鉴定CLDN6的表达1.过表达CLDN6抑制乳腺癌细胞的增殖能力CCK8实验和克隆形成实验检测CLDN6对细胞增殖能力的影响。2.Sp1在CLDN6抑制cyclin D1表达中的作用Western-Blot法检测Sp1及cyclin D1的表达;在过表达CLDN6细胞中瞬时转染Sp1质粒并通过RT-PCR和Western-Blot法对Sp1表达鉴定;Western-Blot检测转染Sp1后cyclin D1的蛋白表达。3.ERK在CLDN6下调cyclin D1抑制乳腺癌细胞增殖中的作用Western-Blot检测过表达CLDN6细胞中ERK的磷酸化水平;Western-Blot检测ERK激动剂PMA处理细胞的最佳作用浓度,及处理细胞后Sp1、cyclin D1的蛋白表达水平;CCK8法和克隆形成实验检测PMA处理对细胞增殖能力的影响。CCK8法检测Sp1抑制剂MTM的IC50值;Western-Blot法检测MTM处理细胞的最佳作用浓度和时间;Western-Blot法检测ERK信号通路激活并抑制Sp1后cyclin D1的表达;CCK8法和克隆形成实验检测ERK信号通路激活并抑制Sp1后对细胞增殖能力的影响。结果:1.过表达CLDN6抑制乳腺癌细胞的增殖能力CCK8结果显示,第3天时,MCF-7克隆组细胞的细胞活力低于空载组,MDA-MB-231克隆组细胞在第4天时,细胞活力低于空载组;克隆形成实验结果显示,两组克隆组细胞克隆形成的数量低于空载组细胞。结果提示,CLDN6降低细胞活力,抑制乳腺癌细胞的增殖能力。2.Sp1在CLDN6抑制cyclin D1表达中的作用Western-Blot结果显示,过表达CLDN6细胞中Sp1及cyclin D1表达水平低于空载组;瞬时转染Sp1,Western-Blot结果显示转染组细胞中的Sp1的m RNA和蛋白水平高于未转染Sp1组;转染组细胞中的cyclin D1表达水平高于未转染组。结果提示,CLDN6可能通过抑制Sp1下调cyclin D1的表达。3.ERK在CLDN6下调cyclin D1抑制乳腺癌细胞增殖中的作用Western-Blot结果显示,克隆组细胞中ERK的磷酸化水平低于空载组,ERK的总蛋白水平不变;Western-Blot结果显示ERK激动剂PMA处理细胞的最佳作用浓度为15n M,并用15n M的PMA处理细胞后Sp1及cyclin D1蛋白表达水平高于未处理组;CCK8实验结果显示,PMA处理后细胞活力高于未处理组;克隆形成实验结果显示,PMA处理后细胞克隆形成的数量高于未处理组。结果提示,CLDN6通过抑制ERK信号通路下调cyclin D1的表达,抑制乳腺癌细胞的增殖能力。CCK8结果显示,Sp1抑制剂MTM的IC50值为503.4n M;Western-Blot结果显示,MTM处理细胞的最佳作用浓度为100n M,处理时间为24h,使用100n M的MTM处理细胞24h后,cyclin D1的表达水平低于未处理组;CCK8实验结果显示,使用PMA和MTM处理细胞后细胞活力低于只使用PMA处理的细胞;克隆形成实验结果显示,使用PMA和MTM处理细胞后细胞的克隆形成数量低于只使用PMA处理细胞组。结果提示,CLDN6通过抑制ERK-Sp1信号通路下调cyclin D1的表达,抑制乳腺癌细胞的增殖能力。结论:CLDN6通过抑制ERK-Sp1信号通路下调cyclin D1表达抑制乳腺癌细胞的增殖能力。