研究背景胃癌(Gastric Cancer,GC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一,死亡率仅次于肺癌居第二位,由于早期胃癌患者无特异性临床症状及体征,多数患者确诊为进展期甚至出现远处转移,治疗效果差,目前,侵袭转移仍是导致胃癌患者死亡最重要的原因。因此,深入研究胃癌侵袭转移的作用分子及调控机制,对于改善胃癌患者的预后具有重要意义。上皮间质转化(Epithelial Mesenchymal Transition,EMT)是肿瘤侵袭转移的重要生物学过程。上皮间质转化的激活使肿瘤细胞失去附着力,更容易从起源位置脱落进而发生迁移,肿瘤细胞由此获得更强的侵袭转移能力。EMT在肿瘤的侵袭转移中起着极为重要的作用。既往研究表明,E-cadherin通过与β-catenin结合形成复合体,介导细胞极性和细胞间黏附的稳定性,调控肿瘤的侵袭与转移,β-catenin的异常积累可以诱导细胞EMT。TRIB3(Tribbles Homolog 3)是Tribbles同源蛋白家族成员之一,含有丝氨酸/苏氨酸激酶样结构域。非典型假激酶域为底物提供了一个结合域,这些底物可被特异性的E3泛素连接酶识别。近年有研究表明TRIB3在多种肿瘤细胞中呈现高表达,参与调节肿瘤细胞的增殖、迁移与侵袭。进一步有研究证实TRIB3的高表达与包括肺癌、乳腺癌、结肠癌在内的多种肿瘤的不良预后相关。然而,TRIB3在胃癌中的生物学作用及其调控机制尚不明确。研究目的数据库分析结合胃癌细胞体外及裸鼠动物模型体内实验,研究TRIB3在胃癌侵袭转移中的作用及临床意义,探讨TRIB3对EMT进程产生的影响,进一步阐明TRIB3在胃癌侵袭转移中的作用机制,以期为胃癌侵袭转移的分子机制提供新的思路,为评价胃癌侵袭转移能力提供新的生物学标志。研究方法1.数据库分析TRIB3在胃癌和癌旁组织中的表达,免疫组化检测TRIB3在胃癌及癌旁组织临床样本中的表达,分析TRIB3与胃癌患者预后之间的关系。2.Transwell实验及Western blot实验分析多种胃癌细胞系TRIB3的表达与侵袭能力的关系。3.通过慢病毒感染建立TRIB3敲低和过表达胃癌细胞系,尾静脉注射建立裸鼠全身转移模型、Transwell侵袭实验、划痕实验等验证TRIB3促进胃癌侵袭转移。4.通过Western blot、实时荧光定量PCR等方法检测干扰胃癌细胞TRIB3表达后,EMT相关标志物及转录因子β-catenin的表达,明确TRIB3对胃癌细胞EMT的影响,探索TRIB3通过促进β-catenin表达进而影响EMT的调控途径。5.加入蛋白合成抑制剂和蛋白酶体抑制剂处理胃癌TRIB3敲低细胞,明确TRIB3是否通过影响β-catenin的蛋白降解影响其表达。6.检测TRIB3对β-catenin蛋白泛素化降解的影响,免疫共沉淀检测二者之间是否存在相互作用。7.免疫组化染色检测临床组织样本TRIB3及β-catenin的表达,进行相关性分析,阐明二者之间的相关性。研究结果1、TRIB3促进胃癌的侵袭转移(1)数据库分析,Tribbles同源蛋白家族成员中仅有TRIB3在胃癌中的表达与癌旁组织中的表达有差异,并且TRIB3的高表达胃癌患者总生存期显著低于低表达患者。免疫组化染色结果也证实TRIB3的高表达与不良预后显著相关,并且在发生转移组织中TRIB3的表达显著高于未发生转移患者。(2)Western blot结果提示,TRIB3的表达与胃癌细胞的侵袭能力呈正相关。裸鼠尾静脉注射全身转移模型中证实,TRIB3敲低后,裸鼠肺上转移的数量显著低于对照组。Transwell实验、划痕实验结果也证实,TRIB3敲低后的胃癌细胞系其侵袭和转移能力显著下降。这些体内外实验结果证实,TRIB3能促进胃癌的侵袭转移。2.TRIB3通过转录后途径调控胃癌细胞的EMT进程(1)TRIB3敲低后,EMT标志物中,E-cadherin的表达增高,而N-cadherin和Vimentin的表达减少,Wnt/β-catenin信号通路关键转录因子β-catenin的表达减少。(2)TRIB3敲低抑制β-catenin的蛋白表达,而TRIB3敲低却并不影响β-catenin mRNA的表达。3.TRIB3抑制β-catenin的泛素化降解进而促进胃癌细胞的EMT。(1)胃癌细胞TRIB3通过泛素蛋白酶体系统影响β-catenin蛋白的降解;(2)敲低TRIB3后促进胃癌细胞β-catenin的泛素化降解;(3)TRIB3和β-catenin蛋白之间存在相互结合。(4)TRIB3和β-catenin的蛋白表达呈显著正相关。研究结论基于以上结果,我们得出以下结论:1.胃癌组织中TRIB3的表达显著高于癌旁组织,转移患者组织中TRIB3的表达显著高于未转移者,且TRIB3高表达患者的生存期较短,提示TRIB3能促进胃癌的侵袭转移。2.TRIB3促进胃癌细胞发生EMT,该过程不是通过转录层面调控β-catenin实现,而是发生在转录后途径。3.TRIB3能抑制β-catenin的泛素化降解,使胞内β-catenin的异常积累,进而促进胃癌细胞发生EMT。TRIB3与β-catenin之间存在相互结合,二者的蛋白表达具有显著相关性。4.TRIB3能促进胃癌的侵袭转移,可作为评价胃癌侵袭转移能力的标志物,并可能是胃癌转移患者潜在的治疗靶点之一。