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第一部分:低氧下HIF-1α调控VEGF与稽留流产发病的关系的研究目的:通过检测缺氧诱导因子-1α(Hypoxi-indueibl factor 1αlfa,HIF-1α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial factor,VEGF)在稽留流产患者绒毛组织的表达及其在体外构建的早孕低氧环境下HTR8/Svneo细胞的相关功能试验,研究HIF-1α调控VEGF在绒毛血管形成中的作用,阐明其在稽留流产发病机制中的临床意义。方法:1、收集稽留流产患者绒毛组织及早孕人流绒毛组织各30例,利用免疫组化方法检测两组标本的HIF-1α、VEGF及CD34标记的微血管密度(Microvessel density,MVD)的表达差异,进一步研究绒毛组织中HIF-1α、VEGF的表达与MVD的相关性。2、低氧(2%O2)与常氧(20%O2)条件下体外培养HTR8/Svneo细胞实验,比较两种不同氧环境下分别培养6小时、12小时、24小时、48小时后细胞的增殖、迁移、侵袭、成管能力的变化。3、Western Blot实验测定低氧与常氧条件培养HTR8/Svneo细胞6小时、12小时、24小时、48小时后HIF-1α蛋白的变化;QRT-q PCR检测低氧条件培养HTR8/Svneo细胞6小时、12小时、24小时、48小时后HIF-1α的m RNA水平的变化;Western Blot实验测定低氧条件培养HTR8/Svneo细胞6小时、12小时、24小时、48小时后VEGF蛋白的表达变化。4、利用si RNA技术沉默HIF-1α后在低氧环境下转染HTR8/Svneo细胞,检测VEGF表达的变化及细胞成管能力的改变。结果:1、稽留流产组绒毛的微血管密度明显低于早孕人流组绒毛的微血管密度(P<0.001),稽留流产组绒毛的HIF-1α、VEGF的平均光密度低于早孕人流组绒毛的表达(P<0.001);在早孕人流组中,MVD与HIF-1α的表达呈正相关(r=0.644,P<0.001),MVD与VEGF的表达也呈正相关(r=0.695,P<0.001);在稽留流产组中,MVD与HIF-1α的表达呈正相关(r=0.898,P<0.001),MVD与VEGF的表达也呈正相关(r=0.940,P<0.001)。2、低氧与常氧条件培养6小时后两组HTR-8/SVneo细胞的增殖、迁移、侵袭、成管能力均差异无统计学意义(P>0.05),低氧培养12、24、48小时后细胞的增殖、迁移、侵袭、成管能力均有统计学差异(P<0.05),低氧刺激一段时间后可以促进HTR-8/SVneo细胞的增殖、迁移、侵袭、成管能力。3、HIF-1α蛋白在常氧下表达极少,低氧下HIF-1α蛋白表达明显高于常氧(P<0.001),低氧下HIF-1α蛋白表达在低氧作用12小时后开始升高,可以稳定至48小时。低氧可以刺激HIF-1αm RNA转录水平,转录水平变化与其蛋白水平变化基本一致。低氧刺激作用下VEGF蛋白的变化也呈现时间依赖性,与HIF-1α蛋白表达基本同步。4、在低氧下沉默HIF-1α后转染细胞,VEGF蛋白的表达明显受到抑制,HTR8/Svneo细胞成管能力明显减弱。结论:稽留流产的发病与绒毛血管形成障碍相关;从临床水平及体外细胞实验证实HIF-1α调控VEGF是绒毛血管形成的关键因素;HIF-1α的下调导致其调控基因VEGF表达的低下,从而引起绒毛血管形成障碍而导致稽留流产的发病。第二部分:低氧下PI3K/AKT调控HIF-1α/VEGF与稽留流产的关系目的:通过对磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)通路在体外低氧环境下的细胞相关实验及通路关键蛋白因子在稽留流产绒毛标本的表达的检测,研究低氧环境下PI3K/AKT通路对HIF-1α/VEGF的调控作用及对细胞成管能力的影响,阐明PI3K/AKT通路调控HIF-1α/VEGF在稽留流产发病中的意义。方法:1、免疫组化测定稽留流产及早孕人流绒毛组织中PI3K、AKT的表达,并分析与MVD的相关性。2、Western Blot实验检测低氧条件培养下在PI3K抑制剂、si RNA技术沉默HIF-1α作用后AKT、HIF-1α、VEGF蛋白水平的改变。3、检测低氧条件培养下在PI3K抑制剂、si RNA技术沉默HIF-1α作用后细胞成管能力的改变。结果:1、稽留流产组绒毛的PI3K平均光密度低于早孕人流组绒毛的表达(P=0.019),稽留流产组绒毛的AKT平均光密度低于早孕人流组绒毛的表达(P=0.046);在早孕人流组中,MVD与PI3K呈正相关(r=0.583,p=0.001),MVD与AKT呈正相关(r=0.533,p=0.002);在稽留流产组中,MVD与PI3K不呈正相关(r=0.264,p=0.159),MVD与AKT不呈正相关(r=0.218,p=0.247)。2、单纯低氧环境可以上调AKT、HIF-1α、VEGF的蛋白表达水平,PI3K抑制剂作用后可以降低AKT、HIF-1α、VEGF蛋白在低氧下的表达水平,HIF-1α沉默后不降低AKT在低氧下的表达水平,低氧环境下PI3K抑制剂与HIF-1α沉默同时作用时HIF-1α、VEGF的表达明显下调。3、HTR8/Svneo细胞成管能力单纯低氧环境下最强,PI3K抑制剂可以降低HTR8/Svneo细胞在低氧下的成管能力,PI3K抑制剂与HIF-1α沉默同时作用时细胞成管能力最低。结论:低氧环境下PI3K/AKT通路激活HIF-1α而上调VEGF的表达,从而调控滋养细胞的成管能力。PI3K/AKT表达低下导致HIF-1α/VEGF的下调,从而引起绒毛血管形成障碍,可能导致稽留流产的发病。第三部分:低氧环境下EGFR调控HIF-1α/VEGF与稽留流产的关系目的:通过对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)在体外低氧环境下的相关细胞实验及其在稽留流产绒毛组织的表达的检测,研究低氧环境下EGFR对HIF-1α/VEGF的调控作用及对HTR8/Svneo细胞成管能力的影响,阐明EGFR调控HIF-1α/VEGF在稽留流产发病中的意义。方法:1、免疫组化测定稽留流产及早孕人流绒毛组织的EGFR的表达及与MVD的关系。2、Western Blot实验检测低氧条件培养下在EGFR抑制剂、si RNA技术沉默HIF-1α作用后EGFR、HIF-1α、VEGF蛋白水平的改变。3、检测低氧条件培养下在EGFR抑制剂、si RNA技术沉默HIF-1α作用后细胞成管能力的改变。结果:1、稽留流产组绒毛的EGFR平均光密度低于早孕人流组绒毛的表达(P=0.019);在早孕人流组中,MVD与EGFR呈正相关(r=0.581,P<0.01);在稽留流产组中,MVD与EGFR呈正相关(r=0.707,P<0.01)。2、单纯低氧环境可以上调EGFR、HIF-1α、VEGF的蛋白表达水平,EGFR抑制剂作用后可以降低EGFR、HIF-1α、VEGF蛋白在低氧下的表达水平,HIF-1α沉默后不降低EGFR在低氧下的表达水平,低氧环境下EGFR抑制剂与HIF-1α沉默同时作用时HIF-1α、VEGF的表达明显下调。3、HTR8/Svneo细胞成管能力单纯低氧环境下最强,EGFR抑制剂可以降低HTR8/Svneo细胞在低氧下的成管能力,EGFR抑制剂与HIF-1α沉默同时作用时细胞成管能力最低。结论:低氧环境下EGFR激活HIF-1α而上调VEGF的表达,从而调控滋养细胞的成管能力。EGFR表达低下导致HIF-1α/VEGF的下调,从而引起绒毛血管形成障碍,可能导致稽留流产的发病。