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副猪革拉瑟氏菌（Glaesserella parasuis,GPS）属于巴氏杆菌科的一种短小杆菌,是猪上呼吸道常在菌。在机体受到应激、免疫力低下或继发感染条件下,侵入上皮细胞、进入血液引发宿主的革拉瑟氏病。该病多发于断奶仔猪,或常见于与其他细菌和/或病毒混合感染的猪群,对生猪养殖业造成严重的经济损失。目前,对该病原的研究主要是对病原毒力因子的挖掘,但对其在上呼吸道定殖以及突破呼吸道屏障的研究较少。已有研究表明:能造成全身系统性感染的菌株都含有lsg B基因,其编码一个α2,3-唾液酸转移酶蛋白,但其具体的机制尚不清楚。本研究从构建lsg B基因缺失菌株出发,在体外细胞模型上证实了该基因缺失能显著降低GPS跨越单层细胞屏障的能力、降低GPS侵入细胞能力、降低GPS在健康猪血清中的存活能力,并发现lsg B基因介导LOS的α2,3-唾液酸化能识别巨噬细胞表面结合唾液酸的免疫球蛋白样凝集素1（Siglec1）,促进TGF-β1的分泌。我们探究了TGF-β1对上皮屏障完整性的影响,深入分析了TGF-β1调控GPS侵入上皮细胞的机制,主要研究内容如下:1.lsg B基因介导LOS发生α2,3-唾液酸化利用自然转化的方法,我们在5型临床分离的强毒株SH0165（以下称野生菌株）中成功获得lsg B基因缺失菌株,并通过穿梭质粒在缺失菌株中回补该基因成功构建其互补菌株。通过高效液相色谱（HPLC）检测证实:相较于野生菌株和互补菌株,缺失菌株表面的α2,3-唾液酸化水平显著降低,lsg B基因造成GPS菌株去唾液酸化。分别提取上述三株菌的LOS,PAGE银染实验进一步证实去唾液酸化降低LOS分子量,表明lsg B基因编码唾液酸转移酶的作用是修饰GPS的LOS发生α2,3-唾液酸化。2.lsg B基因介导LOS的α2,3-唾液酸化影响GPS致病力为探究LOS唾液酸化对GPS致病力的影响,我们分别在猪肾上皮细胞（PK-15）和猪髋动脉内皮细胞（PIEC）上进行了黏附侵入实验,结果表明缺失菌株对于上述两种细胞的侵入能力显著减弱,而黏附能力显著增强。分析LOS结构发现,LOS去唾液酸化后暴露了半乳糖残基,通过半乳糖预处理PK15细胞,再进行黏附实验发现缺失菌株黏附增强的现象被显著抑制。同时,我们探究了唾液酸化对GPS在血清中存活能力的影响,血清杀菌实验结果表明缺失菌株在健康猪血清中的存活率显著降低。WB实验结果表明,缺失菌株表面结合的补体抑制因子f H显著低于野生菌株和互补菌株。流式细胞术结果进一步证实沉积在缺失菌株表面C3b和攻膜复合体（MAC）的量显著高于野生菌株和互补菌株。上述结果表明,GPS唾液酸化通过结合补体抑制因子f H降低菌体表面C3b的沉积和MAC的形成,促进GPS在健康猪血清中存活率。小鼠实验结果表明缺失lsg B基因影响GPS对小鼠的致死率。上述结果表明。lsg B基因在GPS致病过程中发挥重要作用。3.α2,3-唾液酸化促进肺泡巨噬细胞TGF-β1的产生在本研究中,通过细菌的Pull Down实验,我们证实了野生菌株能够与重组的Siglec1发生相互作用,而缺失菌株结合较弱。WB和LOS-ELISA证实LOS的α2,3-唾液酸化与重组的Siglec1发生相互作用。野生菌株和缺失菌株及它们的LOS刺激猪肺泡巨噬细胞3D4/21后,WB检测Siglec1蛋白水平表达,证实α2,3-唾液酸化诱导更高水平的Siglec1表达。免疫组化进一步证实α2,3-唾液酸化诱导Siglec1在肺部的高表达。免疫共沉淀证实α2,3-唾液酸化激活的Siglec1能促进DAP12和Syk表达并形成三聚体激活下游级联反应。通过干扰RNA实验证实α2,3-唾液酸化激活的Siglec1/DAP12/Syk三聚体能促进上清中TGF-β1的分泌。WB证实去α2,3-唾液酸化的缺失菌株激活p38的磷酸化显著低于野生菌株,抑制p38通路后上清中TGF-β1的分泌显著减少。同时,通过抑制剂实验进一步证实Syk抑制剂显著抑制p38磷酸化和上清中TGF-β1的分泌。综上所述,α2,3-唾液酸化通过识别巨噬细胞表面受体Siglec1形成Siglec1/DAP12/Syk三聚体影响p38磷酸化调控TGF-β1的分泌。4.TGF-β1诱导GPS侵入上皮细胞及跨越上皮细胞屏障为证实分泌的TGF-β1对上皮屏障的影响。我们通过重组的TGF-β1蛋白对NPTr细胞进行了体外实验。ECIS结果证实TGF-β1能剂量依赖降低NPTr细胞形成的电阻屏障,TGF-β1受体抑制剂证实其降低NPTr电阻屏障依赖其受体发挥作用。WB结果进一步证实TGF-β1能降低NPTr细胞形成的电阻屏障是下调了NPTr细胞间的紧密连接蛋白。此外,我们还发现TGF-β1能通过依赖其受体的方式增加GPS对上皮细胞的侵入。通过WB和荧光素酶报告系统证实TGF-β1能增加GPS侵入NPTr细胞是通过下调Fn的表达来实现的。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对Fn蛋白进行敲除,证实Fn能影响GPS对气管上皮细胞的侵入能力。以上结果表明,lsg B基因介导的α2,3-唾液酸化在GPS突破上皮细胞屏障过程中发挥作用,细菌通过α2,3-唾液酸化修饰利用宿主免疫细胞表面受体来调控上皮细胞屏障入侵深层组织。5.α2,3-唾液酸化修饰诱导宿主免疫细胞耐受通过构建体外耐受模型,我们发现去α2,3-唾液酸化显著降低LOS诱导的免疫细胞耐受水平,降低耐受细胞上清和小鼠血清中TNF-α的含量,降低Siglec1的表达。在耐受细胞中,WB和co-IP结果表明α2,3-唾液酸化通过诱导Siglec1受体来上调其接头分子DAP12和炎症抑制因子SHIP,并形成复合物。共聚焦实验证实去α2,3-唾液酸化减弱Siglec1与SHIP的相互作用。WB证实耐受细胞中去α2,3-唾液酸化降低p65磷酸化并降低上清中TNF-α和NO的分泌量。干扰RNA实验进一步证实耐受细胞中SHIP的上调依赖于Siglec1的激活。小鼠耐受模型中,α2,3-唾液酸化显著上调小鼠脾脏巨噬细胞中Siglec1的表达。以上结果证实,α2,3-唾液酸化通过诱导Siglec1上调SHIP诱导内毒素耐受。本研究证实了lsg B基因介导的α2,3-唾液酸化在GPS致病力、突破上呼吸道屏障和逃避宿主天然免疫中发挥重要作用。本研究深入探究了α2,3-唾液酸化在GPS在逃避宿主天然免疫、突破屏障和逃避补体杀伤过程中的重要作用,为更好的理解GPS引发系统性疾病提供理论依据。