禽类隐孢子虫调查及防治抗体研制

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寄生于禽类的隐孢子虫有效种为3个即C. meleagridis, C. baileyi, C. galli,其中C. meleagridis作为人隐孢子虫病的第三大感染种类已引起广泛的关注。基于此,作者对河南省部分地区的禽类(鸵鸟、鸭、鸡、鹌鹑)进行了隐孢子虫流行病学调查,掌握了其流行特点。并利用收集获得的鸡源C. baileyi卵囊进行了卵黄抗体的制备与鉴定研究,为进一步开展应用抗隐孢子虫特异性IgY抗体进行隐孢子虫病的治疗与诊断提供基础。2006年6月~2007年7月,对河南地区6个鸵鸟养殖场、8个鸭场、8个规模化鸡场和37个中小规模鸡养殖户、47个鹌鹑养殖场的禽类进行了调查。粪便样品中隐孢子虫的检测用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法进行。结果显示鸵鸟隐孢子虫感染率为1.7%(14/829),鸭隐孢子虫阳性率为16.31%(92/564),蛋鸡、种鸡隐孢子虫感染率为10.57%(163/1542)、肉鸡感染率为3.17%(15/473),鹌鹑隐孢子虫感染率为13.15%(239/1818)。统计数据分析表明幼龄鸵鸟和雏鸭较易感染隐孢子虫,对于鸡,0~31、31~60d的雏鸡和121~180d初产蛋鸡感染率相对较高,育成鸡(60~120d)和产蛋鸡(180d以后)的感染率相对较低。根据形态学鉴定,寄生于鸵鸟、鸭、鸡的隐孢子虫为C. baileyi,而寄生于鹌鹑的隐孢子虫除了C. baileyi外,尚感染有C. meleagridis。利用实验室扩增后的鸡源C. baileyi卵囊,以改进的Sheather蔗糖梯度离心法提纯卵囊,低速离心结合滤膜微滤除菌后,通过反复冻融和超声波处理的全卵囊抗原,以福氏完全和非完全佐剂制备免疫抗原,设定4种免疫程序,免疫5月龄开产健康母鸡。结果显示首免、二免剂量均为5×107个/只,免疫间隔6周,2次免疫的第一组,每次免疫剂量均为1×107个/只,免疫间隔15~20天, 4次免疫的第三组不能取得好的免疫效果,应用免疫抗原量梯度增加的免疫方法的第二组,取得了满意的抗体水平,一免、二免抗原量分别为1×107个/只,2×107个/只,三免、四免抗原量均为3×107个/只,五免、六免抗原量均为5×107个/只,每次免疫间隔15~20d,共免6次。采用间接ELISA法和免疫荧光法对获得的卵黄抗体进行初步鉴定,其具有隐孢子虫属特异性。以水稀释-盐析法纯化本次实验获得的IgY抗体,经SDS-PAGE分析后,卵黄抗体未提纯前呈现12条以上清晰蛋白条带,主要的有136KDa、74KDa、62KDa、49KDa和33KDa蛋白条带,提纯后的IgY抗体,主要有2条蛋白条带,即62KDa左右的重链,33KDa左右的轻链。对获得的IgY抗体进行了免疫荧光定位,显示抗体与卵囊顶部的荧光反应最强且与脱出囊外的子孢子的荧光反应强于卵囊壁。
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