论文部分内容阅读
目的：糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病（diabetes mellitus, DM）最常见、最严重的血管并发症，也是引起终末肾功能衰竭的主要病因。目前认为，DN的发生发展是长期高血糖、脂代谢紊乱、血流动力学异常、一氧化氮生成异常及细胞因子等多因素综合作用的结果，其中长期高血糖是DN的最主要病因和始动因素。研究表明，严格控制上述因素能明显降低DN的发生率，但DN的发生有家族聚集现象,在不同个体有明显的差异性，这些现象均提示除环境因素外，遗传因素在DN 的发生发展中也有重要作用。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)又称为血管通透因子(VPF)，是一种主要作用于血管内皮细胞的丝裂原，通过改变内皮细胞结构与功能、增加肾小球毛细血管通透性、促进细胞外基质(ECM)合成、肾脏肥大等机理参与DN进展。研究表明，早在出现持久微量蛋白尿之前数年，即有血清VEGF浓度的持续性升高，且血清VEGF浓度越高，发展为持久微量蛋白尿的危险性就越大，表明VEGF在糖尿病血管并发症的发生发展中起关键作用，其表达至少部分由基因决定。分子生物学研究发现在VEGF基因5，-非转录区-634bp发生的G→C影响VEGF的产量,被证实是有意义突变。然而人们对此所做的研究还甚少。因此，本研究的目的是:通过检测2型DM患者血清中VEGF水平及其基因<WP=4>型，以明确VEGF在2型DM伴发肾病的发生发展中所起的作用及VEGF-634G/C基因多态性与糖尿病肾病的关系，为阐明糖尿病肾病发生的病理生理学及遗传学机制提供理论依据。方法：按照1997年ADA提出的DM诊断和分型标准，随机选择2002.5-2003.10我院内分泌科、肾内科及老干部科门诊及住院的2型DM患者共216例，根据其尿白蛋白排泄率（UAER）分为糖尿病肾病组104例（6个月内连续3次UAER＞20ug/min,并排除由其它疾病或应用影响肾功能药物引起的蛋白尿）和单纯糖尿病组112例（6个月内连续3次UAER<20ug/min）；正常对照组98例，为同期在我院体检的健康个体。受试者过夜禁食10-12h后，均于晨起空腹抽取肘静脉血5ml，其中1ml用2﹪乙二胺乙酸（EDTA）抗凝，保存在-20℃，用于抽提基因组DNA，余4ml常规分离血清，保存在-20℃，用于生化指标的检测。⑴VEGF基因型检测：①基因组DNA的提取：EDTA抗凝血1ml，用碘化钾法提取外周血白细胞DNA，紫外分光光度法测定DNA的浓度和纯度。②聚合酶链反应－限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)检测VEGF-634G/C基因多态性：以外周血白细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增，50μl的反应体系中含基因组DNA约400ng，上下游引物各1.5ul (10pmmol/ul)，TaqDNA聚合酶2U，dNTP4ul(2.5mmol/ul)，与Taq酶相对应的10хPCR Buffer 5μl，余双蒸水补足。反应在热循环仪上进行：95℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，重复完成30个循环，最后在72℃延伸5min。取PCR产物10μl，加入限制性内切酶 BsmF1 <WP=5>1U，相应酶解反应缓冲液10хBuffer 2μl，BSA 2μl，去离子水补充至总反应体积20μl，于80℃孵育3小时。取酶切产物10μl进行8%非变性的聚丙酰胺凝胶电泳，溴化乙锭染色后于紫外灯下观测基因型，（CC型：304bp；CG型：304bp,193bp,111bp；GG型：193bp,111bp），并摄片计数。⑵生化指标的测定：①用双抗体夹心酶联免疫吸附的方法检测血清中VEGF的水平；②血糖、血脂的测定在全自动生化分析仪上进行；③糖化血红蛋白（HbA1C）、尿微量白蛋白（UmALB）的测定采用免疫比浊法。 ⑶统计学处理：所有数据均输入计算机，用SPSS10.0处理。以Hardy-Weinberg平衡法检验各组基因频率的群体代表性；对所有资料进行正态性检验，正态性分布的资料以均数±标准差（）表示，非正态分布资料以中位数（四分位数间距）表示。计量资料的组间比较用方差分析或秩和检验；计数资料的组间比较用检验；VEGF浓度与其他因素的相关性采用Spearman相关分析和多元回归分析；2型DN发生的危险性用Logistic回归分析。结果：①2型DM组与正常对照组的年龄、性别构成比无显著差别，具有可比性；②2型DM组VEGF水平(565.32±126.35ng/L)较对照组(287.36±98.74ng/L)明显升高，DN组（672.95±139.64ng/L）升高更显著（P<0.01）。③与正常对照组相比，2型DM组BMI、血压、血糖、HbA1C、TC、TG、LDL-C的水平明显升高，HDL-C明显下降（P<0.05或0.01）。DN组的BMI、血压、HbA1C、LDL-C、TG、的水平高于单纯DM组，HDL-C明显低于单纯DM组（P<0.05或0.01）④VEGF与SBP、HbA1C、UAER显著正相关，与年龄、<WP=6>性别、病程、BMI、血脂无显著相关性。⑤糖尿病肾病组CC基因型和C等位基因频率分别是26.9%和51.0%，显著高于单纯糖尿病组（分别为10.7%和34.8%）和正常对照组（分别为10.2%和34.7%）（P<0.01），而CC基因型和C等位基因在单纯糖尿病组和正常对照组间的分布无显著差异性；⑥与GG型组相比，CC型组DN的发生率明显上升，C等位基因携带者血清中VEGF水平明显增加（P<0.01）；⑦Logistic回归分析显示VEGF、VEGF基因多态性、SBP、HbA1C、 LDL-C、BMI是糖尿病肾病的危险因素。 结论：①2型DM患者VEGF水平升高，升高的VEGF与尿白蛋白明显相关，是DN的危险