1.研究背景功能性食品,在近几十年快速发展、国际市场份额与日俱增,集全球生产、消费和研发于一体的西欧、美国、日本等三大地区日渐成为世界功能性食品的聚散地,并逐步推动着该领域相关科学技术与市场经济的双重发展。其中,抗氧化功能性食品,在当今社会更是日渐备受瞩目;尤其是来源于基础科学理论的大量研究指出,自由基是引发细胞病理的主要诱因;抗氧化剂（天然、人工合成）可作为预防机体因氧化应激所造成的生物大分子的系列损伤。而同时,流行病学调查显示,在人群消耗大量富含抗氧化活性物质的蔬菜与水果后,群体慢性病的发病率将得到有效控制。因此,针对机体内部“氧化与抗氧化”,进行的生物机体预防性补充具有抗氧化功能的外源活性物质被视为最为可行的一种模式,并且也得到了众多健康专家的认可。同时探索一套既科学、实用,又可靠、完善的功能性食品抗氧化评价技术,成为摆在我们面前的一项重大课题。从该研究领域发展形势看,自由基理论在众多关于延缓衰老研究学说中是最为倡导的;且围绕该理论进行的抗氧化功能性食品评价也成为其指导思想。在当前,尽管由体外抗氧化能力评价结果直接过渡到体内抗氧化能力评价仍然存在着难以逾越的鸿沟与纷争。但体内直接测定抗氧化活性比较困难,而作为一项可迅捷、客观给出待测受试物其抗氧化能力的一种评价技术,体外评价技术有着显著性的优势。体外抗氧化能力评价技术发展的短短几十年,理化环境下建立起来的DPPH法、ABTS法、FRAP法、TRAP法、ORAC法及TOSC法等得到了广泛的认可;尤其是来自于生物源性的红细胞评价实验、低密度脂蛋白（LDL-OX）氧化修饰实验以及细胞、组织所诱发的损伤性生物标志物等。同时,体内抗氧化能力评价技术也取得了巨大发展,基于自由基理论建立的多种造模、有效的生物标志物及可信的检测技术被认为是比较可靠的功能性实验评价技术。动物模型,被认为是功能性食品评价所必须借助的手段,国内现有功能性食品的抗氧化能力评价技术,常使用老龄鼠作为评价的常用动物模型,但由于其缺乏统一的量化标准,使得用其进行的功能性评价性实验最终的结果存在巨大的疑问。因此,采用外源性方式造成实验动物氧化应激模型被认为是解决老龄鼠进行功能性食品抗氧化能力评价技术不足的良方。常见的三种造模方式,D-半乳糖、γ-辐射及溴代苯等。其中,又以D-半乳糖造模方式被国内科研评价所推崇。国际上关于抗氧化动物模型的造模方式略有不同,但基本上可分为三类。即:通过给予实验动物药物（如:D-半乳糖、CCL4或百草枯、酒精等）,来诱导动物个体,使其处于氧化应激状态;通过给予实验动物营养不平衡饮食,抗氧化剂缺乏膳食（维生素E）,或强化抗氧化膳食（Fe过量）,使其处于氧化应激状态;其他途径,如通过给予辐射、转基因技术以及人工培育（快速老化鼠）和病理模型（糖尿病大鼠模型、高血脂症大鼠模型）等获取抗氧化能力评价动物模型。评价生物氧化损伤状况,选用是否有效、可靠的氧化损伤生物标志物,是决定评价结果可信与否的重点。因此,针对生物体抗氧化系统与氧化损伤开展的探索性研究是主攻方向。血液中存在游离物质,维生素C、维生素E、胆碱、尿酸等均是其研究的重点,而各种氧化酶活性亦是如此;组织的研究靶点主要集中各组织内部抗氧化状况（酶活性、总抗氧化能力）等指示性指标,及氧化损伤后机体尚未来得及修复如初的损伤印记。原有诸多方法的改进完善（HPLC-MDA等）、DNA损伤标志物的检测技术跟进（彗星实验、HPLC、GC-MS等）、蛋白质各样损伤标志物的检测（蛋白质羰基含量、3-硝基络氨酸等）。生物体内的抗氧化防御系统,可通过进食富含外源性抗氧化生物活性物质的膳食加以调节。人群可以在生活中补充足够量的抗氧化活性物质,而进食足量具有抗氧化能力的功能性食品自然成为人们的一个选择。尽管类似的研究结论也不尽相同,研究结果各异,但是,作为一个经济、科研热点与争论焦点,无疑都是一个难以回避的环节。本课题是基于当前该领域的最新研究进展,本着可靠、实效、易操作的原则,力图在本实验室内建立起更新的、优秀的功能性食品的抗氧化能力评价新技术。2.研究方法在评价特定抗氧化剂或抗氧化剂富集膳食时,存在着多种方法。体外抗氧化能力评价,是生物活性物质进行评价必不可少的一道程序,是进一步开展体内评级所必须。在本课题进行中,先后进行体外、体内两部分研究。（1）体外抗氧化能力评价技术的研究ABTS法:ABTS与过硫酸钾（K₂5₂O₈）反应生成评价体系的基础——ABTS·+。当生物活性物质存在时,预先形成的蓝绿色ABTS·+将被还原为无色的ABTS分子形式,其被还原程度和反应时间取决于生物活性物质的抗氧化能力以及浓度。抗氧化能力强弱采用Trolox当量表示,即:以相同条件下测得的生物活性物质的抗氧化活性与Trolox的抗氧化活性作对比,由此得到的比值反映待测生物活性物质的抗氧化能力。FRAP法:在低PH值的环境下,生物活性物质能够将一种叫三吡啶三嗪三价铁[Fe（Ⅲ）-2,4,6-Tri（2-pyridyl）-s-triazine,TPTZ-Fe3+]的物质还原为蓝色的三吡啶三嗪二价铁[Fe（Ⅱ）-TPTZ,,TPTZ-Fe2+]。反应的结果常以Fe2+当量或标准物质的抗氧化能力表示。但该法不能用于检测含有巯基（-SH）的有机物质,因为类似谷胱甘肽等含有巯基的有机物质是不能与三价铁离子发生反应的。根据测定结果,在大批量筛选与评价待测物质（功能因子、混合型生物活性物质等）后,进行排序,甚至分级,以至给出一个较为科学性的评价结论;为进一步开展体内研究（动物实验、人群干预）提供一个必要的参考。（2）体内抗氧化能力评价技术的研究体内抗氧化能力评价,是抗氧化能力功能性评价的重要组成部分,是为功能性食品做出最具有说服力的一道不可逾越的程序性工作。体内抗氧化能力评价有两个重要部分组成,即:1.实验动物模型;2.有效生物标志物。实验动物模型:酒精诱导的氧化应激小鼠模型酒精诱导的氧化应激损伤主要与其在细胞线粒体及微粒体系统内部的代谢有关。由于活性氧/氮自由基在其体内的大量产生,导致机体诱发氧化应激,进而引起损伤。本实验周期维持5周,第1周预灌服低、高剂量槲皮素、姜黄素与维生素C适应。从第2周起,按实验要求加服25%（w/v）浓度的酒精溶液,前后持续4周。最终处死全部实验小鼠,取相应脏器组织测定抗氧化系统状况。镉诱导的氧化损伤小鼠模型镉,是一种广泛存在于人类生活、生产环境中的有毒重金属;其攻击的靶器官主要是肺、肝、肾和睾丸等脏器。由于镉本身只具有一种氧化还原状态,不能直接产生活性氧/氮自由基,所引发的氧化效应也是通过间接发挥作用的,即:使得含有巯基关键分子失活,从而对抗氧化系统和DNA修复系统形成抑制,进而引发损伤。本实验,采用皮下注射7mg/kg·bw的氯化镉溶液的方式,给予实验小鼠急性染毒,24h后处死全部小鼠,取相应脏器组织测定抗氧化系统状况。3.研究结果3.1体外抗氧化能力评价结果3.1.1 ABTS法测定受试物抗氧化活性应用ABTS法分别测定槲皮素、姜黄素、DL-α-生育酚和原花青素,实验进行了三次,实验结果稳定,变化不具有统计学意义（P＜0.05）。从实验得出Trolox抗氧化能力测定标准曲线,曲线方程是:Y=92.661X+2.29,R²=0.999。根据标准曲线,所测定的槲皮素、姜黄素的抗氧化活性TEAC值分别约为2.02、0.50;而1g DL-α-生育酚清除自由基的能力相当于2.06mmol的Trolox清除自由基的能力、1g原花青素清除自由基的能力相当于2.897mmol的Trolox清除清除自由基的能力。3.1.2 FRAP法测定受试物抗氧化活性应用FRAP法的测定实验中,依次测定了槲皮素、姜黄素、DL-α-生育酚、原花青素和Trolox的总抗氧化能力,实验进行了三次,实验结果稳定,变化不具有统计学意义（P＜0.05）。实验首先得出FeSO4抗氧化能力标准曲线（见图2）,曲线方程是:Y=1.095X+0.002,R²=0.999。根据标准曲线,所测定的槲皮素、姜黄素和Trolox的抗氧化活性以1.0mmol/l FeSO4为参考标准,槲皮素摩尔当量约为5.73、姜黄素1.18、Trolox 2.09;而DL-α-生育酚以及原花青素的抗氧化活性分别是207.7mg、156.36mg相当于1.0mmol/l FeSO4。3.2体内抗氧化能力评价结果3.2.1酒精诱发氧化应激小鼠模型研究结果（1）一般性生长情况在动物房内适应1周,未发现各组实验小鼠体重之间存在差异;第1次称重在实验第1周,给各组灌服除酒精外的不同剂量的受试物（姜黄素、槲皮素、维生素C）,未发现各组实验小鼠体重之间存在差异;第2次称重在正式灌胃4天,发现酒精模型组与空白对照组实验小鼠体重之间存在显著性差异;之后每镉3日测定1次,第3次、第4次、第5次、第6次称重,均发现酒精模型组与空白对照组之间存在显著性差异。（2）各组实验小鼠所取脏器重量情况各组实验小鼠脑、肾和肝脏重量测定,发现第Ⅱ组的脑重量高于第Ⅰ组的脑组织重量,但是没有统计学差异;第Ⅱ组肾脏重量低于第Ⅰ组实验小鼠的肾脏重量,而且具有统计学差异;第Ⅱ组肝脏重量与第Ⅰ组相比,略有降低,但不具有统计学差异。（3）各组实验小鼠生化指标的测定情况血浆SOD、Gpx的测定,酒精模型组（第Ⅱ组）与空白对照组（第Ⅰ组）相比,GPx:酶活性降低,具有统计学差异;SOD:酶活性增加,具有统计学差异。肝组织各项生化指标分析,酒精模型组（第Ⅱ组）与空白对照组（第Ⅰ组）相比,GPX:酶活性降低,差异具有统计学意义。PCO:第Ⅱ组与第Ⅰ组相比,含量较高,经检验,具有统计学意义。3.2.2镉诱导氧化损伤小鼠模型研究结果（1）各组实验小鼠脏器的情况各组实验小鼠脏器的比较情况看,发现各组实验小鼠的脑、肾及肝脏部分重量存在显著性差异,脑、肾、肝等脏器重量:第Ⅱ组与第Ⅰ组对比,各自重量都有不同程度的增加,但不具有统计学差异;实验小鼠的脑、肝脏,增加比较明显,尤其是第Ⅱ组与第Ⅰ组相比,经检验具有统计学差异。（2）血浆中MDA含量测定结果各组实验小鼠血浆MDA含量测定结果上看:第Ⅱ组与第Ⅰ组相比,血浆MDA含量显著性高,具有统计学差异。（3）脑组织MDA和PCO含量及肾脏PCO含量测定结果各组实验小鼠脑组织中MDA和PCO含量看,第Ⅱ组与第Ⅰ组相比,丙二醛（MDA）与蛋白质羰基含量（PCO）均有所升高,且经检验,具有统计学差异:第Ⅲ、第Ⅳ、第Ⅴ组MDA和PCO含量均有明显升高;而第Ⅱ组的肾组织蛋白质羰基含量（PCO）与第Ⅰ、第Ⅲ、第Ⅳ与第Ⅴ组相比,高于其余各组,且具有统计学差异。（4）肝组织SOD、CAT、MDA、PCO测定结果第Ⅱ组与第Ⅰ组相比,肝组织中SOD、CAT等酶活性不同程度的降低,经检验具有统计学差异;第Ⅰ、第Ⅲ、第Ⅳ、第Ⅴ组与第Ⅱ组相比,酶活性均降低,且具有统计学差异。第Ⅱ组与第Ⅰ组相比,丙二醛（MDA）和蛋白质羰基含量（PCO）等生物标志物较高,且具有统计学差异;第Ⅲ、第Ⅳ、第Ⅴ组与第Ⅱ组相比,丙二醛（MDA）和蛋白质羰基含量（PCO）也较高,具有显著性差异。（5）肝脏DNA损伤产物——8-羟基脱氧鸟苷测定结果各组实验小鼠肝脏8-羟基脱氧鸟苷测定结果看,第Ⅱ组与第Ⅰ组相比,发现8-OHdG含量显著性高于第Ⅰ组,且经检验具有统计学差异;其余各组也有不同程度的变化,与第Ⅱ组也具有明显差异,与第Ⅰ组相比未发现差异。4.研究建议在本课题中,体外抗氧化能力评价实验部分建立了理化环境下的评价方法ABTS法与FRAP法,缺乏生物源性的评价程序,略显结构上欠妥,因此,建议加入红细胞溶血实验、LDL-OX实验共同作为体外筛选评价实验。在体内抗氧化能力评价实验部分,酒精诱导的氧化应激动物模型作为国际上比较成熟的一种实验模型,包括蛋白质羰基含量（PCO）在内的部分指标出现了相应变化,但酒精氧化应激动物模型的应用仍有待进一步探讨。镉急性中毒所诱发的氧化损伤模型,蛋白质羰基含量（PCO）、8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）均明显发生改变;但是检测两者的方法仍需加以完善,尽量采用HPLC、GC-MS等比较客观的检测方法,以及以8-异前列腺素为代表的一系列可靠性生物标志物。