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第一部分:Sorangiumcellulosium So0157-2中两个内切酶的异源表达及性质分析纤维堆囊菌是唯一能降解结晶纤维素的粘细菌并能将结晶纤维素作为唯一碳源生长利用。Sorangium cellulosum So0157-2中含有丰富的纤维素降解酶类,其在降解结晶纤维素中的作用一直鲜有报道,单一酶组分的特性及作用是值得研究的内容。实验室前期研究表明纤维堆囊菌中的纤维素降解酶类表现为与菌体或纤维素底物结合在一起,呈现接触依赖型降解,这给单一酶组分的分离带来困难,限制了单一酶组分的生化性质的研究。本部分工作首先对S.cellulosum So ce56及So0157-2中的纤维素降解酶类进行了模块结构分析,发现其不含有组成纤维小体的锚定域,且两株菌的基因组中亦未发现组成纤维小体的脚手架蛋白及相关粘附域。另外,两株菌的纤维素降解酶中仅极少数含有纤维素结合结构域(CBM),均仅含一个外切葡聚糖酶,含有丰富多样的内切葡聚糖酶。结合实验室前期工作中显示纤维堆囊菌不采用游离酶系统降解纤维素,亦区别于纤维小体降解策略的前提,推测其采用一种特有的策略进行纤维素的降解。选取S.cellulosum So0157-2基因组中预测到的唯一的GH8家族的内切葡聚糖酶基因ScCel8A,成功构建重组表达载体pET-22b-ScCel8A,并进行异源表达后获得活性重组纯化蛋白r-ScCel8A。对其进行酶学性质分析发现,最适pH值为6.0,最适温度为45℃。pH稳定性结果显示r-ScCel8A具有较强的耐碱特性,在pH=7.0-10.0范围内4℃放置18h后仍能保持80%以上活性,温度稳定性结果显示r-ScCel8A无法耐受较高温度,60℃处理5min后酶活降低至20%以下,处理lh后基本丧失活性。低浓度下,多种金属离子如Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Li+对酶活均有一定的促进作用。高浓度下,所有的离子均表现出一定的抑制作用,其中Fe3+、Mn2+使酶完全丧失活性。CTAB对酶活表现出强烈的抑制作用。r-ScCel8A仅对lichenan、barley、CMC表现出一定的酶活,其作用于barley的Km 值为 3.2 mg/ml,Vmax 为 96.697μmolmin-1mg-1,Kcat 为 73.74 s-1,Kcat/Km为23.67mLmg-1 s-1。作用于barley的产物出现在纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖的位置,为典型的内切葡聚糖酶,降解底物生成不同的寡糖。选取S.cellulosum So0157-2基因组中预测到的具有CelD-N结构域及糖苷水解酶9家族(GH9)催化结构域的内切葡聚糖酶基因ScCel9A,成功构建重组表达载体pBADgⅢ A-ScCel9A,得到纯化重组蛋白r-ScCel9A。对其进行酶学性质分析发现,该酶的最适底物为木葡聚糖,对CMC、barley、lichenan也具有一定的活性。以木葡聚糖为底物进行r-ScCe19A的Km及Vmax的测定结果为:Km值为 1.38mg/ml,Vmax 为 5.813 μmolmin-1mg-1。其最适 pH 值为 4.0,偏酸性,pH耐受性测定发现pH=7.5-12范围(除去pH=8.5)内放置17h后仍能保持60%以上活性,但在Tris-HCl缓冲液pH=8.5条件下,酶活急剧下降至10%以下,总体来讲,该酶具有一定的耐碱特性。另外,该酶的最适温度为25℃,在0℃放置30min后测定仍然能保持20%左右的酶活,说明该酶具有一定的嗜冷特性,温度耐受测定结果显示,该酶在不同温度条件下放置1h后,低于35℃范围内,酶活能维持在80%以上,高于此温度后酶活急剧下降,表现出无法耐受高温的特性。多种金属离子当在高浓度时会抑制酶的活性。化学试剂中DTT、咪唑对酶活影响不大,EDTA在高浓度时对酶活具有一定的抑制作用,所测浓度的SDS均会使酶失去活性。对该酶的CelD-N结构域截短后进行表达,发现粗酶液中r-ScCel9A-CD的可溶性降低,主要以包涵体形式存在,活性降低,对底物CMC失去活性。第二部分:5-甲基吡嗪-2-羧酸(MPCA)的生物转化法的探究5-甲基吡嗪-2-羧酸(MPCA),分子式为C6H6N202,是一种重要的医药中间体,用于合成第二代口服降血糖药格列吡嗪、新型抗高血压药阿西莫司等多种药物。现有合成方法主要有化学合成法、电化学氧化法和生物合成法,三种方法均以2,5-二甲基吡嗪(DMP)为原料,化学合成法存在污染大、副产物产生、步骤繁杂等缺点,电化学氧化法存在高能耗等缺点,生物法因其产物单一、环保、可实现一步合成等优点成为一种最有发展前途的方法。MPCA的生物法合成技术目前尚不成熟,现今国内的2,5-二甲基吡嗪(DMP)仅作为香料少量生产,作为生物转化法原料进行医药中间体合成的案例几乎属于空白。本论文对其生物转化法进行初步探究。本论文根据恶臭假单胞菌ATCC33015能降解利用甲苯、二甲苯及带甲基的杂环芳香族化合物的特性,通过对诱导剂对二甲苯添加方式的探究,选择将对二甲苯添加在10ml离心管中的脱脂棉上并在离心管盖上留两个孔,使对二甲苯以挥发形式供给。DMP浓度对菌体生长影响实验中发现10mM、50mMDMP均能使菌体正常生长,故在后续应用实验中可选择添加50mM底物来提高转化效率。由于MPCA为酸类物质,在发酵培养基中存在盐的情况下极容易生成盐类物质,故在对产物进行萃取时应进行酸化,适宜pH值为1-2。为提高底物转化效率,对发酵条件中的悬浮培养基进行优化,发现1271培养基作为悬浮液时底物转化效率最高且几乎无中间产物产生。另外,为对底物的转化效率进行定量分析,首先制作了 MPCA标准曲线,然后对底物持续添加实验中的结果进行了 HPLC定量分析,发现结果与TLC结果基本一致,但底物转化效率有待提高,后续可通过发酵条件的进一步优化进行。但在实验小试过程中,对二甲苯以挥发形式的添加造成挥发量难以控制,导致底物DMP的转化不稳定,目的产物MPCA无法持续稳定产生,所以考虑在大肠杆菌中进行转化。与DMP降解相关的基因存在于恶臭假单胞菌ATCC33015的pWWO质粒上,xylM、xyLA基因共同编码二甲苯单加氧酶(XMO),可将甲苯氧化为苯甲醇,xylB基因编码苯甲醇脱氢酶,将苯甲醇氧化为苯甲醛,xylC基因编码苯甲醛脱氢酶,将苯甲醛氧化为苯甲酸。文献曾报道xylM4基因编码的酶可参与甲苯至苯甲酸氧化的过程,故在大肠杆菌中进行异源表达时,为探究三个酶不同组合情况下对底物转化的影响,将xylC、xylM、xylA、xyLB基因克隆后,连接到载体pET-28a上,成功构建四个重组质粒 pET-28a-xylMA、pET-28a-xylMAB、pET-28a-xylCMA、pET-28a-xylCMAB并进行异源表达。然后将含四个重组质粒的工程菌进行发酵,在发酵体系中添加底物DMP后,不同时间点取样检测是否存在终产物MPCA的产生。结果发现,含重组质粒pET-28a-xylMA的发酵体系,产物中仅检测到中间产物的存在,未发现终产物MPCA;含重组质粒pET-28a-xylMAB的发酵体系,产物中仅检测到极少量MPCA,主要产物为中间产物;含重组质粒pET-28a-xylCMA的发酵体系,产物中检测到一定量的MPCA,但仍以中间产物为主;含重组质粒pET-28a-xylCMAB的发酵体系,产物以MPCA为主。综上所述,当同时表达四个基因时,含重组质粒pET-28a-xylCMAB的发酵体系最适于进行底物DMP至终产物MPCA的转化。但若进行工业化应用,还需对发酵条件进行优化,提高底物转化率。