背景慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD,以下简称为慢阻肺）是一种常见的慢性气道炎症性疾病,以不完全可逆的气流受限为特点,常呈进行性加重,具有较高的发病率及病死率,并给家庭和社会带来沉重的经济负担。慢阻肺的发病机制尚未完全阐明,香烟烟雾暴露是其最重要的独立危险因素之一。吸入香烟烟雾等有害颗粒或气体可引起气道氧化应激、炎症反应以及蛋白酶/抗蛋白酶失衡。多种炎症细胞参与慢阻肺的气道炎症,包括巨噬细胞、中性粒细胞、以及Tc1、Tc17、Th17和ILC3淋巴细胞等。激活的炎症细胞释放多种炎性介质作用于气道上皮细胞,诱导上皮杯状化生和气道粘液高分泌;慢性炎症刺激气道上皮释放生长因子,促进气道周围平滑肌增生,导致小气道重构;巨噬细胞基质金属蛋白酶和中性粒细胞弹性蛋白酶等引起肺结缔组织中的弹性蛋白破坏,导致不可逆肺损伤,引发肺气肿。这些病理改变最终导致了进行性的气流受限,形成慢阻肺。Neddylation是一种新型的类泛素化修饰,和其他的类泛素化修饰如SUMOylation相比,Neddylation的小分子NEDD8与泛素化的Ub具有高度的同源性。蛋白质类泛素化Neddylation修饰异常已经被证实与包括肺癌在内的多种肿瘤的发生发展密切相关。研究表明Neddylation-CRL（Cullin ring ligase）蛋白质机器在肺癌组织中高度活化,且与不良预后显著相关;基因敲除小鼠或MLN4924失活Neddylation-CRL蛋白质机器,可以明显抑制Kras^G12D诱发的肺癌,并明显延长癌变小鼠的生存期;其小分子抑制剂Pevonedistat（MLN4924）作为一种治疗恶性肿瘤的方法已在多种恶性实体瘤和血液病进行临床试验。肺部慢性炎症被认为可以促进整个肺癌发生过程。慢阻肺、肺结核和肺炎患者也不同程度地增加肺癌的风险;而长期服用非甾体类抗炎药物,如阿斯匹林,可以明显降低肺癌的风险。基于此,我们猜想,Neddylation-CRL蛋白质机器是否对慢性炎症性疾病如慢阻肺是否同样具有重要的调控作用。本文将关注慢阻肺上皮损伤和肺气肿两个重要病理特征,从上皮和巨噬细胞两方面阐释Neddylation修饰在慢阻肺发病机制中的作用。第一部分类泛素化Neddylation E2 UBE2M在慢性阻塞性肺疾病上皮损伤中的作用及机制研究目的在气道上皮细胞中,研究类泛素化Neddylation修饰在香烟烟雾诱导的气道上皮损伤与粘液分泌中的作用及相关机制。方法1. 动物模型/人体样本检测利用6-10周龄的WT小鼠,以香烟烟雾整体暴露构建经典的慢阻肺小鼠模型,获取肺组织,免疫组化/WB检测其肺组织Neddylation修饰信号通路相关蛋白的改变;收集慢阻肺患者及对照组肺组织样本,免疫组化/WB/rt-q PCR检测Neddylation修饰信号通路相关分子的表达;构建气道上皮细胞特异性诱导敲除UBE2M的CC10-rt（Tet O）₇-Cre-UBE2M^flox/flox小鼠并构建基于香烟烟雾暴露和弹性蛋白自免疫的慢阻肺炎症模型,检测Neddyation修饰信号通路在气道上皮损伤中的作用。2.体外细胞实验利用人气道上皮细胞系HBE,予以香烟烟雾提取物（Cigarette smoke extract,CSE）刺激模拟体内香烟烟雾暴露模型;应用Neddylation特异性的小分子抑制剂MLN4924,Neddylation信号通路相关小干扰NEDD8-si,APPBP1-si,UBE2M-si,研究失活Neddylation修饰信号通路对CSE诱导的上皮细胞炎症和粘液表达的影响;利用c-JUN-si研究AP-1信号通路在Neddylation修饰调控CSE诱导的炎症和粘液分泌的作用。结果1. Nedd8在肺组织中具有相当高的表达丰度;慢阻肺患者和小鼠香烟烟雾整体暴露模型肺组织中Neddylation修饰信号通路相关蛋白存在不同程度的上调;2. 小分子抑制剂抑制或小干扰RNA沉默Neddylation修饰信号通路相关分子能缓解CSE诱导的上皮细胞炎症和粘液分泌;3.失活AP-1信号通路可以保护CSE诱导的上皮细胞炎症和粘液分泌;4.气道上皮细胞特异性诱导敲除UBE2M的小鼠在基于香烟烟雾暴露和弹性蛋白自免疫的慢阻肺炎症模型中,炎症和粘液分泌明显得到缓解。结论香烟烟雾暴露上调气道上皮细胞Neddylation水平;上皮细胞Neddylation修饰可能通过上调下游p-JNK激活AP-1信号通路来介导CS/CSE诱导的上皮损伤。第二部分类泛素化Neddylation E2 UBE2M在慢性阻塞性肺疾病肺气肿发病的作用及机制研究目的在巨噬细胞中,研究类泛素化Neddylation重要E2连接酶UBE2M在慢阻肺肺气肿发生发展过程中的调控作用及相关机制。方法1.转录组测序构建髓系特异性敲除UBE2M的Lys M^Cre-Ube2m^flox/flox的小鼠失活巨噬细胞Neddylation信号通路,获取其骨髓来源巨噬细胞进行转录测序,获得敲除小鼠与对照小鼠中慢阻肺发病相关的差异性表达基因。2. 动物模型/人体样本检测利用6-10周龄的WT小鼠,以香烟烟雾整体暴露构建经典的慢阻肺小鼠模型,获取支气管肺泡灌洗液,检测其巨噬细胞Neddylation修饰信号通路相关蛋白的改变;收集慢阻肺患者及对照组支气管肺泡灌洗液,免疫荧光检测UBE2M蛋白的表达;构建Neddylation失活的髓系特异性敲除UBE2M的Lys M^Cre-Ube2m^flox/flox检测其基础状态下及香烟烟雾暴露后肺泡平均间隔的改变。3. 体外细胞实验利用Neddylation失活的髓系特异性敲除小鼠的骨髓来源巨噬细胞、腹腔来源巨噬细胞;同时利用Neddylation特异性小分子抑制剂MLN4924,HIF-2α转位抑制剂PT2385,抑制小鼠巨噬细胞细胞系MH-S和人单核来源巨噬细胞系THP-1。研究UBE2M-HIF-2α-MMP12调控轴对慢阻肺肺气肿发病机制的调控作用。结果1.转录组学提示在巨噬细胞中敲除Neddylation修饰关键E2连接酶后,慢阻肺发病相关的MMP12表达增高;2.Lys M^Cre-Ube2m^flox/flox小鼠出现自发性的肺气肿;3. 慢阻肺患者和小鼠香烟烟雾暴露整体模型的支气管肺泡灌洗液中UBE2M表达量降低,MMP12增高,Lys M^Cre-Ube2m^flox/flox小鼠表型一致;4. Neddylation可能通过调控下游底物HIF-2α的降解来维持稳态时MMP12平衡。结论香烟烟雾暴露下调巨噬细胞中UBE2M的水平,失活巨噬细胞Neddylation修饰信号通路;可通过导致其底物HIF-2α的聚集,激活MMP12分泌,诱发肺气肿。