硫化氢（hydrogen sulfide,H₂S）作为一种气体分子,参与生物体多种生理病理过程。硫化氢参与调节多个系统的病理生理过程,如神经系统、内分泌系统、心血管系统等。内源性及外源性硫化氢均在疼痛中发挥重要作用。N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid,NMDA）受体是一种配体门控离子型谷氨酸受体,其亚型B在脊髓中发挥重要的疼痛传导作用。有研究显示,NMDA受体的激活介导了福尔马林诱发的痛觉过敏,其产生与外周组织和神经损伤有关。在中枢神经系统中,硫化氢诱发海马长时程动作电位（long-term potentiation,LTP）,其方式主要通过增加NMDA受体磷酸化介导的电流而产生。糖尿病（diabetic mellitus,DM）是一种以血糖升高为主要特征的代谢性疾病,高血糖易导致心血管系统、泌尿系统、神经系统等慢性损害及功能障碍。糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy,DPN）是一种最常见的糖尿病慢性并发症,患者受累的感觉神经分布区常常发生针刺样、烧灼样、电击样疼痛,严重影响日常生活质量。有报道指出,在糖尿病患者中,周围神经病变性疼痛的发生率约为7.5%-24%。认知功能障碍主要表现为记忆力障碍及智能减退,同时伴有学习能力和执行力下降以及人格和行为改变。有研究显示高血糖可引起大脑神经元损害,也有报道将认知功能障碍归结为糖尿病晚期并发症之一。硫化氢存在多种神经保护作用,已被国内外大量实验所证实,主要包括抗神经炎症反应、抗氧化应激损伤和抗缺氧缺血性神经损伤。有研究表明阿尔茨海默病患者脑中硫化氢水平显著降低,同时同型半胱氨酸水平升高,且程度与病情严重程度呈正相关。硫化氢可增加神经细胞的可塑性,从而减少海马神经元的凋亡。临床上,糖尿病患者术后发生认知功能障碍的风险明显高于非糖尿病患者,其认知功能障碍的发生与内源性硫化氢的关系尚不明确,右美托咪定是一种高选择性α2肾上腺素受体激动剂,可通过中枢和外周机制,减少免疫炎症反应中炎性细胞因子的生成。本研究探讨硫化氢参与疼痛的机制和硫化氢在糖尿病神经痛大鼠认知功能中的作用及机制,并且评价右美托咪定对糖尿病患者术后认知功能的影响及血浆中硫化氢的影响,为临床治疗提供参考。第一部分硫化氢参与大鼠痛觉过敏的形成目的:硫化氢（hydrogen sulfide,H₂S）是一种内源性神经递质,主要调节各种生理和病理过程,包括疼痛信号转导。本研究旨在观察硫化氢对大鼠行为学影响及在脊髓背角和背根神经节中对NMDA受体2B m RNA和蛋白表达的影响,为临床疼痛治疗提供新的策略。方法:清洁级雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠连续5天足底注射NaHS和福尔马林,每天一次,观察最后一次给药后2小时大鼠双侧足底机械缩足阈值（paw withdrawal threshold,PWT）变化及脊髓背角和背根神经节（dorsal root ganglion,DRG）中NMDA受体2B mRNA和蛋白水平;足底注射NaHS前鞘内注射5-磷酸吡多醛依赖性酶-胱硫醚-β-合成酶（cystanthionine-β-synthetase,CBS）抑制剂羟胺（Hydroxylamine,HA）或硫化氢的清除剂高铁血红蛋白（methemoglobin）,观察给药后2小时对侧足底PWT变化;大鼠鞘内注射NaHS前鞘内注射NMDA受体阻断剂美金刚（memantine）,于给药后15min,30min,45min,60min,120min时观察大鼠对侧后足PWT变化。结果:大鼠连续5天足底注射NaHS可显著降低对侧后足PWT,而注射福尔马林对大鼠对侧后足PWT无明显影响;福尔马林诱发的痛觉过敏大鼠中脊髓背角和背根神经节中NMDA受体（NMDA receptor,NMDAR）-2BmRNA和蛋白水平显著升高;NaHS诱发的痛觉过敏大鼠脊髓背角中NMDAR-2BmRNA和蛋白显著升高,而背根神经节中NMDAR-2BmRNA和蛋白水平无明显变化;足底注射NaHS前鞘内注射羟胺或高铁血红蛋白可减轻NaHS诱发的对侧后足痛觉过敏;大鼠鞘内注射NaHS前,鞘内注射美金刚可减轻NaHS诱发的对侧后足痛觉过敏。小结:足底注射外源性硫化氢导致大鼠对侧后足痛觉过敏;足底注射福尔马林不能导致大鼠对侧后足痛觉过敏;外源性硫化氢所致大鼠对侧后足痛觉过敏的机制可能脊髓背角NMDAR-2B的上调有关。第二部分海马硫化氢参与糖尿病神经痛大鼠认知功能障碍的形成目的:观察糖尿病神经痛大鼠的行为学变化,测定糖尿病神经痛认知功能障碍大鼠海马中硫化氢含量及CBSmRNA和蛋白含量。方法:将24只清洁级雄性SD大鼠分为对照组和糖尿病神经痛组（n=12）,通过腹腔注射佐脲链菌素60 mg/kg制作糖尿病神经痛大鼠模型,分别于试验开始前5d进行Morris水迷宫适应性训练,于成模当天及成模后7、14、21、28d分别行Morris水迷宫检测,记录每只大鼠的逃避潜伏期和穿越平台区的次数及平台停留时间。水迷宫检测后处死大鼠行HE染色观察海马CA1区锥体细胞病理改变、TUNEL法检测海马区细胞凋亡、液相色谱测各组海马组织内源性硫化氢含量、测定大鼠海马CBSmRNA和蛋白的表达。结果:糖尿病神经痛大鼠在成模后14d、21d和28d的Morris水迷宫逃避潜伏期均明显延长,21d和28d时穿越平台次数和象限停留时间明显减少;糖尿病神经痛大鼠海马CA1区细胞排列紊乱,锥体细胞排列松散,不整齐,海马内出现核固缩现象,存在神经细胞的缺失;糖尿病神经痛大鼠海马神经细胞凋亡较对照组明显增多,海马内硫化氢含量降低,海马内CBSmRNA和蛋白水平减少。小结:糖尿病神经痛大鼠会产生认知功能障碍,随着时间推移其认知功能障碍加重;糖尿病神经痛大鼠认知功能障碍与神经细胞的凋亡、海马硫化氢及CBS含量降低有关。第三部分外源性硫化氢对糖尿病神经痛大鼠中枢认知功能的影响目的:观察外源性硫化氢对糖尿病神经痛认知功能障碍大鼠行为学的影响及机制的研究。方法:60只清洁级雄性SD大鼠分为5组:对照组（C组）、糖尿病神经痛组（DNP组）、低浓度硫化氢保护组（DSL组）、高浓度硫化氢保护组（DSH组）及单纯硫化氢对照组（S组）（n=12）。分别于试验开始前5d进行Morris水迷宫适应性训练及成模当天及成模后7d、14d、21d和28d分别行Morris水迷宫,记录每只大鼠的逃避潜伏期。HE染色观察海马CA1区细胞病理改变及细胞凋亡情况。测定各组大鼠海马脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）/酪氨酸蛋白激酶受体（tyrosine related receptor kinase,Trk）B、NMDAR-2A/2BmRNA和蛋白水平;免疫组化测定大鼠海马β淀粉样蛋白（amyloid-βpeptide,Aβ）-40和β-淀粉样蛋白前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）水平;RT-PCR法测定大鼠海马APPmRNA、β-分泌酶（β-secreatase,BACE）1mRNA水平;RT-PCR法测定大鼠海马炎性因子白细胞介素1β（Interleukin-1β）mRNA、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α,TNF-α）mRNA、核因子κB65（nuclear factor-kappa B,NF-κB65）mRNA。结果:Morris水迷宫结果:DSL组21d、28d时逃避潜伏期较DNP组缩短,DSH组14d、21d和28d时逃避潜伏期较DNP组缩短。DSL组、DSH组海马细胞排列及形态较DNP组有所改善。DSL组和DSH组海马神经细胞凋亡较DNP组减轻。与C组比较,DNP组大鼠海马BDNF/TrkBmRNA和蛋白表达明显降低;与DNP组比较,DSL组、DSH组大鼠海马BDNF/TrkBmRNA和蛋白表达明显增加,且呈剂量依赖性。与C组比较,DNP组大鼠海马NMDAR-2A/2BmRNA和蛋白表达明显增高;与DNP组比较,DSL组和DSH组大鼠海马NMDAR-2A/2BmRNA和蛋白水平明显降低,且呈剂量依赖性。免疫荧光显示DNP组Aβ-40、APP较C组阳性细胞明显增多,胞浆着色明显加深,IHS评分分析显示:DNP组IHS评分较C组明显增高,DSH组IHS评分较DNP组明显降低,DSL组IHS评分与DNP组比较无明显变化。DNP组大鼠海马APPmRNA、BACE1mRNA表达量明显高于C组;与DNP组比较,DSL组和DSH组大鼠海马APPmRNA、BACE1mRNA相对表达量降低。与C组比较,DNP组海马促炎因子IL-1βmRNA、TNF-αmRNA、NF-κB65mRNA增加;与DNP组比较,DSL和DSH组海马IL-1βmRNA、TNF-αmRNA、NF-κB65mRNA基因表达均明显减少。小结:糖尿病神经痛大鼠可产生认知功能障碍,腹腔注射NaHS可改善其认知功能;腹腔注射NaHS对糖尿病神经痛大鼠认知功能的改善与剂量相关;其机制与抑制Aβ增加、BDNF/TrkB通路、减少炎性因子以及下调NMDAR-2A/2B的表达有关。第四部分硫化氢在糖尿病患者围术期认知功能中的作用目的:观察右美托咪定（Dexmedetomidine,Dex）对糖尿病患者脊柱手术术后认知功能的影响及硫化氢在糖尿病患者围术期认知功能中的作用。方法:从2016年12月至2017年5月,前瞻性收集我院糖尿病患者全麻下行腰椎内固定手术患者60例,ASAⅠ-Ⅲ级,采用随机数字表法分为2组（n=30）:对照组（C组）和右美托咪定组（D组）,于麻醉诱导前30min（T0）、手术结束时（T1）和术后第2d（T2）观察血清中TNF-α、IL-6、IL-10、CRP的浓度变化,同时测定血乳酸和血糖。分别于T0和T2采集患者静脉血,ELISA法测定血清中S100β浓度,分光光度计法测定血清中硫化氢浓度。并于手术前一天、T2及术后一个月进行简易精神状态量表（MMSE）评分,并对两组患者术中全麻药物的用量、术后认知功能障碍的发生情况、住院时间等进行比较。结果:与T0比较,两组患者T2时TNF-α、IL-6、CRP明显升高（P<0.05）,两组患者T1、T2时IL-10显著升高（P<0.05）。T2时,D组TNF-α、IL-6水平显著低于C组;IL-10水平显著高于C组（P<0.05）。与T0比较,两组患者T1时血乳酸和血糖明显升高（P<0.05）。与T0比较,两组患者T2时血清S100β浓度明显增高,D组患者血清S100β浓度降低。两组患者手术前后血清中硫化氢含量未见明显变化（P>0.05）。T2时,两组患者MMSE评分较术前明显降低,D组MMSE评分明显高于C组（P<0.05）,术后2d认知功能障碍发生率D组明显低于C组（P<0.05）。D组术中麻醉药瑞芬太尼、丙泊酚用量明显少于C组（P<0.05）。小结:右美托咪定可降低糖尿病患者脊柱手术术后早期认知功能障碍的发生率,其发生机制与减少全麻药物的使用,降低促炎因子及S100β的升高,促进抑炎因子的升高有关。硫化氢在糖尿病患者围术期认知功能中的作用还需进一步探讨。结论:1.足底及鞘内给予外源性硫化氢可导致大鼠对侧后足痛觉过敏,抑制硫化氢的生成或清除硫化氢可减轻大鼠对侧后足痛觉过敏。其机制与外源性硫化氢上调脊髓背角NMDAR-2B受体有关。2.糖尿病神经痛大鼠随时间逐渐出现认知功能障碍,其严重程度与时间呈正相关。糖尿病神经痛大鼠认知功能障碍与海马神经细胞凋亡有关。糖尿病神经痛大鼠海马内硫化氢含量降低,其认知功能障碍的形成与内源性硫化氢减少有关。3.糖尿病神经痛大鼠会随着时间推移逐渐产生认知功能障碍,腹腔注射NaHS能改善其认知功能,高浓度NaHS改善作用更明显。其作用机制与Aβ通路、BDNF/TrkB通路、抑制炎性因子的增加以及下调NMDAR-2A和NMDAR-2B的表达有关。4.右美托咪定可降低糖尿病患者脊柱手术术后早期认知功能障碍的发生率,其发生机制与减少全麻药物的使用,降低促炎因子及S100β的升高,促进抑炎因子的升高有关。硫化氢在糖尿病患者围术期认知功能中的作用还需进一步探讨。