论文部分内容阅读
目的:本研究介绍具缺氧响应和放疗增敏作用纳米载体递送化疗药物替莫唑胺,协同放射治疗脑胶质瘤,观察其是否对脑胶质瘤细胞放疗敏感性有增强作用,并探讨其效果。方法:1.运用核磁共振谱检测聚甲硝唑纳米聚合物P(MIs)25合成是否成功;2.运用马尔文粒度仪(Nano-ZS粒度测定仪)和透射电子显微镜检测含聚甲硝唑基团的纳米载体Angiopep-2(A2)-P(MIs)25和对照组不含聚甲硝唑基团的纳米载体A2-PLGA构建是否成功;3.运用酶标仪检测聚甲硝唑纳米聚合物A2-P(MIs)25对化疗药物替莫唑胺(temozolomide,TMZ)的包封率;4.运用MTT实验检测A2-P(MIs)25和A2-PLGA的毒性;5.运用荧光显微镜和流式细胞仪检测P(MIs)25/DOX和A2-P(MIs)25/DOX释放阿霉素(DOX)进入C6胶质瘤细胞量的变化;6.通过集落形成实验、细胞免疫荧光实验验证A2-P(MIs)25对C6细胞株放疗增敏性的影响;7.运用活体成像仪检测C6原位小鼠脑胶质瘤荧光强度的变化,绘制荧光强度变化统计图;8.运用TUNEL法检测C6细胞的凋亡状态;监测模型小鼠生存状况并绘制小鼠的生存曲线和体重变化曲线;9.运用HE染色检测A2-P(MIs)25和A2-P(MIs)25/TMZ对模型小鼠主要脏器的毒性效应。结果:1.脂质-聚合物的制备及其性质检测:(1)核磁检测结果显示,聚甲硝唑纳米聚合物P(MIs)25合成成功;(2)马尔文粒度仪(Nano-ZS粒度测定仪)和透射电子显微镜检测结果显示,含聚甲硝唑基团的纳米载体A2-P(MIs)25和对照组不含聚甲硝唑基团的纳米载体A2-PLGA构建成功,所有纳米粒子的粒径均呈正态分布;(3)酶标仪检测结果显示,A2-P(MIs)25可有效负载TMZ。2.细胞水平检测:(1)MTT实验检测结果显示,当A2-P(MIs)25浓度达到1000μg/m L时,C6细胞株存活率仍高于90%,证明A2-P(MIs)25脂质-聚合物纳米颗粒毒性很低;(2)荧光显微镜和流式细胞仪检测结果显示,A2-P(MIs)25/DOX实验组所检测到的荧光强度比P(MIs)25/DOX实验组强(P<0.01),表明A2具有靶向脑胶质瘤的能力;(3)克隆集落形成实验结果显示,与PBS组、A2-PLGA组相比,缺氧环境下A2-P(MIs)25组的C6细胞株克隆形成率明显下降(P<0.01);缺氧环境下A2-P(MIs)25联合放疗可以显著地增强γ-H2AX的表达(P<0.01)。表明了A2-P(MIs)25在缺氧环境下可以增强X线电离辐射的治疗效果,是有效的放射增敏剂。3.动物水平上的检测:(1)稳转荧光素酶的C6细胞原位小鼠脑胶质瘤模型构建成功;(2)根据小鼠脑胶质瘤模型C6细胞荧光强度、生存时间及体重变化的统计结果显示,A2-P(MIs)25/DOX组中的DOX荧光强度最强,A2-P(MIs)25/TMZ+放射治疗(radiation therapy,RT)组的胶质瘤增殖速度最缓慢,体重下降最平缓,中位生存期最长(P<0.01)。表明A2-P(MIs)25可更有效的携带化疗药物靶向到脑胶质瘤组织;P(MIs)25是有效的放射增敏剂,A2-P(MIs)25+RT有效地增强了X射线电离辐射的治疗效果。TUNEL实验结果显示,与PBS组、PBS+RT组、A2-PLGA+RT组、free TMZ+RT组、A2-P(MIs)25+RT组和A2-PLGA/TMZ+RT组相比较,A2-P(MIs)25/TMZ+RT组对于脑胶质瘤细胞增殖的抑制作用及脑胶质瘤细胞凋亡的促进作用最为显著(P<0.01)。(3)HE染色未观测到A2-P(MIs)25/TMZ脂质-聚合物纳米颗粒对心肝脾肺肾组织造成明显的损害,证明A2-P(MIs)25/TMZ生物相容性好、毒副作用低。结论:我们成功研发A2-P(MIs)25/TMZ纳米载体递送缺氧放疗增敏剂和TMZ协同放射治疗脑胶质瘤。体内外实验结果表明,A2-P(MIs)25/TMZ能有效地靶向胶质瘤,抑制胶质瘤细胞生长,显著延长小鼠的生存时间,且无明显毒副反应。因此,本研究研制的A2-P(MIs)25/TMZ提高胶质瘤的放疗敏感性,实现放射与TMZ协同治疗,为胶质瘤治疗提供一种强有力的新策略。