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帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是仅次于阿尔兹海默症(Alzheimer’s Disease,AD)第二大神经退行性疾病。帕金森病的病理特征是中脑黑质致密部(substantia nigra pars compacta,SNc)多巴胺(dopamine,DA)能神经元进行性丢失,进而导致其主要投射区纹状体DA递质的耗竭,伴有路易小体(Lewy body,LB)沉积,临床特征主要是静止性震颤、肌强直、运动减少、姿势步态异常。多种因素参与了 PD的发生发展,包括环境因素、遗传因素、免疫功能异常、神经炎症、氧化应激过度、线粒体功能障碍、兴奋性毒性等,然而其确切病理机制尚未完全阐明。目前治疗PD主要应用左旋多巴替代疗法,但长期应用后大部分患者会出现运动障碍等严重不良反应。因此,深入探讨PD病理机制,探索PD治疗新策略和研发理想的PD神经保护剂具有重大的科学意义。星形胶质细胞是哺乳动物脑内数量最多,体积最大,分布最广泛的一类细胞,是大脑环路的重要成分。星形胶质细胞不仅参与构成血-脑屏障,而且能分泌各种营养因子。星形胶质细胞能通过其表面的转运体、受体与膜离子通道感受神经元信号的输入,产生多种输出信号,释放多种神经递质如、谷氨酸(glutamate,Glu)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)、D-丝氨酸。近年来,靶向于调节星形胶质细胞的功能已经成为治疗PD等神经退行性疾病的新方法。Glu是中枢神经系统最重要的神经递质,但当其含量病理性升高时,会引发神经元兴奋性毒性损伤乃至死亡,此病理过程存在于很多神经系统疾患中,如PD、癫痫、肌萎缩侧索硬化症以及脑卒中等。因此,维持脑内Glu稳态,可能成为PD治疗中新的神经元保护策略。谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)特异表达于星形胶质细胞。当Glu能神经元兴奋后,释放Glu至突触间隙,主要通过星形胶质细胞表面的Glu转运体-1(glutamate transporter-1,GLT1)和 Glu 天冬氨酸转运体(glutamate-aspartate transporter,GLAST)再摄取。被摄取的 Glu 经 GS 转换成谷氨酰胺(glutamine,Gln);Gln作为Glu前体,被星形胶质细胞传递给神经元,再次转换成Glu。GABA能神经元可将Glu在Glu脱羧酶作用下生成GABA释放至突触间隙,主要由GABA转运体1(GABAtransporter-1,GAT1)再摄取进入突触前神经元,被摄取至星形胶质细胞主要由GABA转运体3(GABAtransporter-3,GAT3)执行。被摄取到星形胶质细胞的GABA通过三羧酸循环生成酮戊二酸再生成Glu,Glu在GS作用下生成Gln,形成Gln-Glu/GABA循环。本文第一部分工作,应用C57BL/6J小鼠制备亚急性1-甲基,4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)PD 模型中,检测黑质和纹状体星形胶质细胞功能蛋白GLT1和GLAST、GS、GABA转运体GAT3、多巴胺转运体(Dopaminetransporter,DAT)的表达变化,并明确这些指标的变化和DA能神经元丢失之间时程关系。在此基础上,本文第二部分工作进一步探讨抑制GS对MPTP诱导的帕金森模型小鼠的作用。本研究发现,在MPTP诱导的PD模型中,星形胶质细胞功能性蛋白表达的变化,不是DA能神经元丢失后的继发反应。抑制GS,氨基酸类递质平衡被打破,加重MPTP诱导的PD样病理进程,导致DA能神经元丢失更加显著。本研究进一步揭示Glu代谢稳态失衡加剧DA能神经元丢失,为研发通过靶向调节星形胶质细胞GS表达,维持递质稳态,从而保护DA能神经元提供了理论依据。第一部分小鼠MPTP模型中星形胶质细胞功能性标记物的表达变化目的:为了阐明星形胶质细胞功能性蛋白的变化和DA能神经元丢失之间时程关系。方法:选用C57BL/6J雄性小鼠,皮下注射MPTP20mg/kg,一日一次,一组连续注射2天,一组连续注射6天。最后一次MPTP注射后6天进行行为学检测,评价小鼠运动协调能力和运动速度。酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase,TH)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)与离子钙接头蛋白-1(ionized calcium binding adaptor molecule-1,Iba-1)免疫组织化学染色法观察小鼠中脑DA神经元的损伤、以及黑质-纹状体星形胶质细胞和小胶质细胞的活化。应用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测小鼠纹状体单胺类和氨基酸类递质水平。应用Western blot法检测小鼠中脑和纹状体的星形胶质细胞功能性标记物在MPTP造模过程中的变化。结果:1)行为学测试结果显示,同对照组相比,MPTP造模2天组的小鼠爬杆时间、棒上停留时间以及运动协调能力和运动速度无显著性差异;但MPTP造模6天组的小鼠棒上停留时间缩短,运动协调能力下降,运动速度无显著变化。2)病理组织学分析结果显示MPTP造模2天的小鼠,TH阳性神经元有下降趋势,但没有统计学差异。MPTP造模6天小鼠,TH 阳性神经元较对照组大量丢失。HPLC结果显示,MPTP造模2天的小鼠,纹状体DA及其代谢产物双羟基乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetic acid,DOPAC)、高香草酸(homovanillic acid,HVA)含量较对照组减少,造模6天组含量进一步减少。MPTP造模对脑内 Glu、GABA、Gln、天冬氨酸(Asparticacid,Asp)、牛磺酸(Taurine,Tau)以及丝氨酸(Serine,Ser)含量都没有显著性改变。3)MPTP造模2天的小鼠,中脑和纹状体星形胶质细胞显著活化,但小胶质细胞活化不明显。MPTP造模6天的小鼠,星形胶质细胞和小胶质细胞均出现增殖活化。4)Western Blot结果显示,MPTP造模2天小鼠,同对照组相比,中脑和纹状体Glu转运体GLT1表达下调,GS、GAT3表达上调。MPTP造模6天,GLT1表达下调,GS表达进一步上调,水通道蛋白-4(aquaporin-4,AQP4)和DAT表达显著下调,中脑GLAST表达没有显著变化,但纹状体表达下调,GAT3仍然处于高表达水平。结论:1.星形胶质细胞功能性蛋白表达的变化早于DA能神经元丢失。2.上述星形胶质细胞功能性蛋白的变化,可能具有代偿性维持MPTP所致PD样病理过程中Glu和GABA代谢稳态的功能。第二部分抑制谷氨酰胺合成酶加重MPTP帕金森病模型小鼠的神经损伤目的:研究抑制谷氨酰胺合成酶影响氨基酸递质平衡对MPTP诱导的PD样病理进程是否具有加剧作用。方法:选用C57BL/6J雄性小鼠,皮下注射MPTP20mg/kg,连续打6天。腹腔给药给予L-蛋氨酸磺酸盐(methioninesulfoximine,MSO)20mg/kg隔日给药,持续2周。最后一次MPTP注射后6天进行行为学检测,评价小鼠运动协调能力和运动速度。应用TH、GFAP和Iba-1免疫组织化学染色法观察小鼠中脑以及纹状体DA能神经元的损伤和星形胶质细胞、小胶质细胞增值活化。应用HPLC检测小鼠纹状体单胺类和氨基酸类递质水平。应用Western blot法检测小鼠纹状体和中脑的星形胶质细胞功能性标记物的变化。结果:1)行为学结果显示,MSO加重MPTP组小鼠运动功能障碍。与MPTP造模组相比,MSO+MPTP组小鼠爬杆时间延长,棒上停留时间缩短,运动协调能力下降,运动速度变慢。2)病理组织学结果显示,MSO加重中脑DA能神经元进行性丢失。较MPTP造模组相比,MSO+MPTP组中脑TH阳性神经元进一步减少。HPLC结果显示,与MPTP造模组相比,MSO+MPTP组纹状体DA及其代谢产物DOPAC、HVA含量减少,兴奋性氨基酸Glu、Asp,抑制性氨基酸GABA和Tau含量上调,Ser含量上调。3)较MPTP造模组相比,MSO+MPTP组小鼠中脑和纹状体的星形胶质细胞进一步增殖活化。4)Western Blot结果显示,与对照组相比,MSO组和MSO+MPTP组小鼠,中脑和纹状体星形胶质细胞GS表达下调。与对照组相比,MSO组小鼠中脑和纹状体GLT1表达上调,GAT3表达下调,GLAST在中脑表达没有显著变化,但在纹状体表达上调。MSO+MPTP组中脑和纹状体DAT表达较MPTP组进一步下调。结论:1.MPTP诱导的PD样病理进程,星形胶质细胞活化,通过代偿性上调GS和GAT3的表达以维持Glu和GABA代谢的稳态平衡。2.给予GS抑制剂MSO,破坏纹状体氨基酸类递质平衡,加重TH神经元的丢失、纹状体的DA水平下降,最终加剧MPTP模型小鼠运动协调能力障碍。综上所述,本文工作的创新之处在于:1.明确星形胶质细胞功能性蛋白的变化和DA能神经元丢失之间时程关系。MPTP造模2天的小鼠,TH神经元数量有下降趋势,没有统计学差异时,SNr、SNc和以及主要接受SNc多巴胺纤维投射的背侧纹状体内星形胶质细胞已明显活化。星形胶质细胞功能性蛋白表达的变化早于DA能神经元丢失。2.抑制谷氨酰胺合成酶加重MPTP诱导的帕金森病模型小鼠神经损伤。抑制GS,加重MPTP诱导的PD样病理进程:加重小鼠运动功能障碍;加重SNcTH神经元丢失;进一步降低纹状体的DA及其代谢产物DOPAC、HVA水平;破坏纹状体氨基酸类递质平衡。