核糖开关(Riboswitch)是位于基因5’端非翻译区的RNA功能元件,其无需其他蛋白或转录因子的参与即可特异性地结合代谢物,实现高效动态调控基因表达。然而,天然的核糖开关响应底物浓度的范围较为有限,且响应方式单一,极大地限制了核糖开关在代谢工程与合成生物学中的广泛应用。基于核糖开关的特性,开展其在动态调控产物合成途径方面的研究有着重要的科学意义与良好的应用前景。甘氨酸核糖开关是目前已知的20多种天然的核糖开关中唯一的激活型(ON)核糖开关。甘氨酸核糖开关位于编码甘氨酸剪切酶系的gcvTHP操纵子上游非编码区,包含能结合甘氨酸的两个串联适体区域。巴氏固氮梭菌的工业应用价值颇高,是当前实际生产过程中不可或缺的厌氧型工业微生物,在代谢工程以及合成生物学的实际应用中有着广阔的应用前景和重要的科学研究意义。本研究旨在构建巴氏固氮梭菌甘氨酸核糖开关报告载体,确定调控基因表达的甘氨酸浓度范围;并进一步对巴氏固氮梭菌甘氨酸核糖开关进行定向改造,最终阐明该核糖开关动态调控基因表达的机制,为巴氏固氮梭菌的代谢工程及合成生物学研究提供新的技术与工具。本篇论文以大肠杆菌W3110为宿主,分别构建甘氨酸核糖开关与半乳糖苷酶基因(lacZ)基因和红色荧光蛋白基因(mRFP)的融合载体,通过测定半乳糖苷酶的酶活与荧光强度,确定天然的甘氨酸核糖开关响应甘氨酸的有效浓度范围为10 mM-60mM。随后,基于红色荧光蛋白报告载体,确定在对基因表达的调控方面,适体-2比适体-1更为重要。基于此,通过应用核糖开关双向筛选技术,进一步地将天然的活型(ON)核糖开关定向改造为阻遏型(OFF)核糖开关,并获得一系列能响应不同浓度的甘氨酸核糖开关。