背景与目的结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是最常见的恶性肿瘤之一。虽然绝大多数CRC患者接受了外科切除治疗和辅助放化疗,但由于患者体内存在少量难以清除的微小残留癌组织而发生复发或转移导致患者死亡。近年来,分子靶向治疗因其具有疗效独特和安全性高等特点而成为肿瘤研究的热点和主流方向。G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCRs)是人体内最大的膜受体蛋白家族,在癌的发生和转移过程中发挥关键作用。这种7次跨膜蛋白受体的结构特征、在信号传导中的重要作用及其固有活性特征决定了其可以作为很好的药物靶标,现在药物研发中有60%-70%的目标蛋白是GPCRs,有一些针对GPCRs的靶向抗肿瘤药物在临床试验中已证实具有良好的治疗效果。因此,对某些在结直肠癌发生和进展过程中发挥关键作用的GPCRs的寻找及其分子机制的研究具有重要意义。富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor5, Lgr5)是近年来新发现的一种新的7次跨膜GPCRs家族成员,它作为Wnt/β-catenin下游靶基因,在胚胎发育和器官形成过程中发挥重要作用；同时,最近有研究发现它是一种肠干细胞标记物,并可在CRC中出现过表达,甚至有人猜测它可能是一种CRC干细胞标记物。另外,还有研究发现其可在人类肝癌、卵巢癌、食管腺癌和皮肤基底细胞癌等中过表达。2011年,虽然已证实R-spondin是Lgr5的配体,但目前其细胞内信号通路机制还不清楚,而且Lgr5与CRC的发生、维持和转移之间的关系还不甚明确,而且还鲜见其参与CRC发生和发展的分子机制的研究报道。如果一旦明确Lgr5能够参与CRC的发生和进展,必将为以Lgr5为靶点的CRC选择性靶向药物开发及治疗提供重要实验依据。基于此,本研究通过对人类102例CRC、18例腺瘤和12例正常黏膜组织以及42例Ⅳ期CRC的原发灶和转移灶内Lgr5的表达水平进行检测,并通过刘LoVo细胞内Lgr5表达水平进行干扰下调,旨在(1)探索Lgr5过表达与CRC发生以及β-catenin之间的关系；(2)研究分析Lgr5mRNA和蛋白过表达与CRC侵袭转移、HER2和VEGF蛋白表达以及Ki-67增殖指数等之间的关系；(3)建立Lgr5低表达LoVo细胞模型,并通过该模型研究Lgr5与LoVo细胞增殖、侵袭或迁徙能力、VEGF蛋白表达以及上皮-间叶转化(EMT)表型特征等之间的关系。材料和方法本研究所用人体CRC样本均为南京大学医学院附属鼓楼医院病理科存档病例,标本收集和使用按照南京大学医学院附属鼓楼医院道德伦理委员会关于人体标本使用的协议进行。第一部分中,将102例CRC、18例腺瘤和12例正常结直肠黏膜(2002年～2007年)进行组织芯片(TMA)构建,然后采用EnVision两步法进行Lgr5、p53、β-catenin的免疫组化(IHC)染色。此外,本研究还对21例此前已被证实Lgr5阳性的CRC组织中的侵袭性边缘和肿瘤中央的Lgr5表达水平进行了对比。第二部分中,将42例Ⅳ期CRC病例中的正常黏膜、原发灶、淋巴结转移灶和远处转移灶组织(2009年～2011年)分别进行IHC标记和荧光定量RT-PCR (qRT-PCR)检测,以分析各组组织内Lgr5的表达水平。同时,本试验还对42例Ⅳ期CRC标本进行了HER2、VEGF和Ki-67的IHC检测,并分析Lgr5与上述标记物表达水平以及CRC患者预后的相关性。此外,还对本组样本中51个癌组织蜡块中的肿瘤中央、侵袭性边缘和坏死周围残留癌组织中的Lgr5蛋白表达水平进行了对比分析。第三部分中,本研究采用高侵袭和转移能力的CRC细胞株LoVo细胞作为研究载体,首先验证LoVo细胞内高表达Lgr5,然后采用siRNA技术将Lgr5表达下调并进行验证,最后通过透射电镜观察细胞超微结构特征、通过MTT法分析细胞增殖情况、通过流式细胞术分析细胞周期分布情况、通过transwell试验分析细胞迁徙运动能力、通过Western blot试验研究VEGF和EMT相关蛋白表达水平等方面是否出现相应变化。数据统计分析采用SPSS16.0软件(SPSS,Chicago,IL)进行。组间计量资料比较采用单因素方差分析(one way ANOVA),组间计数资料比较采用x2检验进行和Fisher’s精确检验,相关性分析采用Spearman等级相关分析。采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验评估对比分析存活概率。当P值小于0.05时,差异具有统计学意义。结果基于TMA的IHC标记结果显示,在正常黏膜、腺瘤和CRC中,Lgr5阳性表达率分别为0%(0/12)、28%(5/18)和54%(55/102),Lgr5在CRC中的表达比例要显著高于腺瘤和正常黏膜(P<0.05)；而β-catenin细胞核阳性率分别为25%(3/12)、27%(5/18)和81%(83/102)。P53在正常黏膜和腺瘤中不表达,在CRC中表达率则高达40%(41/102)。正常黏膜中仅见个别Lgr5阳性的肠上皮细胞且局限于隐窝基底部干细胞区域,而在腺瘤中,Lgr5阳性细胞则明显增多,且呈簇状分布于整个隐窝。在Lgr5阳性的CRC中,大部分病例中Lgr5阳性细胞呈局灶或簇状分布,少数呈弥漫片状分布。在CRC中,Lgr5在女性CRC患者中阳性表达率要明显高于男性患者(P<0.001),且与β-catenin的细胞质/核表达呈明显相关性(P<0.01)；但与CRC患者的年龄、肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、pTNM分期和突变型p53表达并无显著相关性(P>0.05)。对比21例I～Ⅳ期CRC标本中的肿瘤中央和侵袭性边缘区域的Lgr5表达水平发现,二者并无显著差异(P>0.05)。在42例Ⅳ期CRC病例中,与相应正常黏膜相比,有71.4%(30/42)的CRC原发灶癌组织出现Lgr5mRNA的表达升高,两组之间Lgr5的mRNA表达水平具有显著差别(P<0.01)。将51个Ⅳ期CRC组织蜡块中侵袭性边缘癌组织、坏死灶周围残留癌组织分别与癌巢中央的IHC标记结果相比,结果发现前两组中Lgr5蛋白的表达水平均显著提高(P<0.05),而肿瘤出芽性处癌组织也常呈较强的Lgr5蛋白阳性表达。qRT-PCR结果显示,远处转移灶癌组织内Lgr5mRNA的表达水平要显著高于原发灶癌组织(P<0.05),而IHC检测结果发现Lgr5蛋白表达水平在淋巴结转移灶和远处转移灶内也均显著增高(P<0.05)。此外,两次IHC结果显示Lgr5在Ⅳ期CRC病例(92.9%,39/42)中的阳性率要远高于Ⅰ～Ⅳ期CRC标本(54%,55/102)(P<0.001),而通过IHC所检测到的HER2蛋白过表达率也较高(IHC3+：28.9%；IHC3+或2+：42.1%),但Lgr5和HER2蛋白过表达与患者预后均未见明确相关性。然而,Lgr5与HER2蛋白过表达、Ki-67增殖活性之间均可见明显相关性(P<0.05)。在Ⅳ期CRC中,IHC标记结果显示93.9%(31/33)的病例出现不同程度的VEGF表达,其中VEGF阳性表达病例中有71%(22/31)病例呈中等或较强表达,但Lgr5与VEGF表达之间并未见相关性。本试验对LoVo细胞内Lgr5mRNA表达的干扰沉默效果为90%。但将Lgr5干扰下调后,MTT试验和流式细胞学试验结果未显示细胞增殖和细胞周期分布出现明显改变；而transwell试验却显示,Lgr5干扰沉默LoVo细胞组transwell小室下层细胞数量明显减少,与对照组和阴性对照组相比具有显著差异(P<0.01)；并且western blot试验结果显示VEGF蛋白的表达水平显著低于阴性对照组和对照组(P<0.01),EMT相关蛋白中上皮显型蛋白E-cadherin表达明显增高,而间叶显型蛋白a-SMA的表达水平则显著降低,它们的表达水平与阴性对照组和对照组相比均具有显著差异(P<0.01)。此外,Lgr5干扰下调后LoVo细胞的超微结构特征也发生明显变化,表现为细胞表面微绒毛明显减少、缩短变平或大部分消失,分布不均匀；细胞质中微丝微管变细、变短和减少；线粒体空泡化明显,部分嵴消失；粗面内质网减少,溶酶体增多。结论Lgr5和β-catenin在结直肠正常黏膜、腺瘤以及CRC中的表达水平和阳性细胞部位均发生了显著变化,提示Lgr5表达水平上调参与了CRC的早期发生过程,并可能与Wnt/β-catenin信号通路密切相关。对于Ⅳ期CRC病例,Lgr5在转移灶和侵袭性边缘或坏死灶周围残留癌组织内的表达水平分别显著高于原发灶和肿瘤中央,提示Lgr5过表达参与了CRC的局部侵袭、区域或远处转移以及死亡抑制过程；Lgr5分别与HER2过表达和Ki-67增殖活性之间均可见明显相关性,但Lgr5和HER2过表达与患者预后均无相关性。逆转Lgr5的高表达状态能够减弱LoVo细胞的迁徙能力、下调VEGF蛋白的表达水平、改变EMT显型(E-cadherin蛋白表达上调、α-SMA蛋白表达下调)以及超微结构特征(微绒毛减少、微丝微管减少和线粒体空化等),但短期内未见LoVo细胞体外增殖能力降低的证据。