论文部分内容阅读
禽大肠杆菌病是由禽病原性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli, APEC)引起的一种常见而重要的细菌性传染病,且易与其它病原性细菌、病毒并发或继发,给世界范围内的养禽业造成了巨大的经济损失。铁是细菌代谢必须的营养因子,细菌生长所需铁(离子)浓度约为10-7mol/L病原性大肠杆菌天然形成了特定的利用铁元素的系统(specific iron assimilation system), Williams最早在大肠杆菌中发现了这一系统,这一系统由嗜铁体(siderophore)、气杆菌素(aerobactin)的合成和气杆菌素特定的外膜蛋白受体(由iutA编码)的表达两部分组成。细菌的这两种成分在铁饥饿(iron starvation)的情况下,均能得到强烈诱导表达。流行病学调查表明,气杆菌素相关基因只存在于有毒力菌株,在无毒力菌株中未发现。气杆菌素是由5个基因编码的,它们共处于一个操纵子,其中参与气杆菌素的合成是iucA、iucB、iucC和iucD4个基因,第五个基因iutA编码一种膜蛋白受体。本研究旨在探讨编码气杆菌素家族的iucC、 iutA基因与APEC致病性之间的关系,了解APEC iucC与iutA基因突变株的生物学特性,为揭示APEC的致病机理和特异性防治措施奠定基础。本研究运用等位基因交换的方法构建iucC、iutA的单基因和双基因缺失突变株。PCR扩增带有酶切位点的iucC、iutA基因并将其插入到pBSK载体多克隆位点中相应酶切位点处,再运用分子克隆的方法将Zeocin抗性基因和Kanamycin抗性基因分别插入到目的基因iucC和iutA中,构建出带Zeocin抗性基因标志的载体pS-iucC-Zeo和带Kanamycin抗性基因标志的载体pS-iutA-Kan。PCR扩增片段iucC-Zeo和iutA-Kan,并电转化入带有质粒pKD46的禽病原性大肠杆菌分离株E058中,在Red重组系统中的质粒pKD46表达重组酶的帮助下,筛选出E058株的基因突变株E058iucC及E058iutA,将片段iucC-Zeo电转化入带有质粒pKD46的单突变株E058iutA中,筛选出双突变株E058iucCiutA。Southern blot的结果显示Zeocin、Kanamycin抗性基因在APEC E058株的基因组中的插入是单拷贝的；RT-PCR结果表明突变株的iucC、iutA基因不能转录,而其上下游基因的转录未受到影响。体外生长曲线的测定结果表明E058iucC、 E058iutA及E058iucCiutA株和E058株在生长速度上几乎没有差异；回复拯救突变株E058iucC以及E058iutA, Aerobactin产生试验结果显示突变株E058iucC及E058iucCiutA不能产生Aerobactin,而野生株E058、E058iutA、回复株Re-E058iucC和Re-E058iutA可以产生Aerobactin;提取细菌外膜蛋白(OMPs), SDS-PAGE结果表明经低铁环境诱导后,E058、E058iutA以及回复株Re-E058iutA在74kDa大小IutA蛋白处没有差异。E058、E058iucC、E058iutA及E058iucCiutA株的半数致死量(LD5o)分别为1044、105。、1046和105’CFU,表明突变株的毒力有-定的下降；在体外,E058iucC、E058iutA及E058iucCiutA株与亲本株E058的竞争指数(CI)值分别为1.00,0.96,0.87,结果表明E058iutA及E058iucCiutA在体外被轻度致弱,而E058iucC来致弱；在体内,攻毒后24h,E058iutA与亲本株E058在鸡肝脏的CI值为0.003,脾脏的CI值为0.006,心血的CI值为0.071,肾脏CI值为0.073,肺脏的CI值为0.216,而E058iucC及E058iucCiutA与亲本株各脏器的CI值均大于0.1,结果表明,对大多数受检脏器,三个突变株均被轻度致弱,但对于E058iutA,其在肝、脾中被高度致弱,在心血和肾脏中为中度致弱；35日龄SPF鸡体内动态分布结果提示攻毒后24h,三个突变株在受检脏器中的细菌数较APEC E058株均有不同程度的下降,其中,E058iutA、E058iucCiutA在血液和肺脏中有明显下降。12日龄SPF鸡胚的致死性实验结果显示E058组死亡率为90.0%,而E058iucC、E058iutA及E058iucCiutA突变株组死亡率分别为86.7%、83.3%及80%,表明突变株的毒力有一定的下降。上述结果揭示iucC基因对APEC E058株气杆菌素的合成起关键性的作用,iutA基因的缺失对APECE058株气杆菌素的表达没有影响并且对APEC E058株IutA蛋白的表达也没有影响；尽管在某些情况下,统计学差异并不显著,但相对于E058iucC, E058iutA突变株的致病性下降似乎更为明显。气杆菌素家族iucC、iutA单个基因或两者缺失引起APEC E058株的致病性下降的趋势明显。