【摘 要】
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背景FK506结合蛋白3（FK506 binding protein 3,FKBP3）是一种胞质/核的肽基脯氨酰顺反式异构酶（peptidyl-prolyl cis-trans isomerase,PPIase）,参与细胞周期调控、细胞骨架形成、RNA代谢、染色质修饰和癌症进展等多种细胞生物学过程。基础转录因子3（basic transcript factor 3,BTF3）是四大基础转录因子之一
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背景FK506结合蛋白3（FK506 binding protein 3,FKBP3）是一种胞质/核的肽基脯氨酰顺反式异构酶（peptidyl-prolyl cis-trans isomerase,PPIase）,参与细胞周期调控、细胞骨架形成、RNA代谢、染色质修饰和癌症进展等多种细胞生物学过程。基础转录因子3（basic transcript factor 3,BTF3）是四大基础转录因子之一,研究显示BTF3在多种肿瘤细胞中表达上调,参与调节细胞凋亡和调控基因转录等多种进程。m TOR是非典型丝氨酸/苏氨酸激酶,m TOR信号通路能够促进蛋白质和脂质的合成、抑制细胞凋亡和自噬、为肿瘤细胞提供有利的生存环境进而参与多种肿瘤的发生和发展。我们前期研究发现在食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）中FKBP3表达上调,且FKBP3能促进ESCC的细胞增殖及肿瘤形成,但具体机制不明;在ESCC细胞中,FKBP3敲低能够下调BTF3的蛋白表达。在此基础上,我们进一步探讨FKBP3促进ESCC细胞增殖和肿瘤发生的具体分子机制。方法通过蛋白质免疫印迹、实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,qPCR）和放线菌酮（Cycloheximide,CHX）捕获实验,研究FKBP3敲低后BTF3在蛋白表达水平、m RNA表达水平及其半衰期的变化。通过免疫组化实验,研究BTF3在ESCC组织中的表达情况;利用si RNA技术在ESCC细胞中敲低BTF3,并进行克隆形成实验和CCK-8实验,研究BTF3对细胞增殖能力的影响;通过FKBP3敲低后过表达BTF3的回复实验,研究FKBP3与BTF3对细胞增殖能力的影响及二者的关系;利用si RNA技术和蛋白质免疫印迹,研究FKBP3与BTF3对细胞自噬的影响;在ESCC细胞中敲低FKBP3,通过蛋白质组学分析和转录组测序（RNA-Seq）,筛选FKBP3敲低后表达上调或下调的分子,并用蛋白质免疫印迹进行验证表达上调的锌指蛋白281（zinc finger protein281,ZNF281）等可能的下游靶分子;在ESCC细胞中进行ZNF281敲低,并通过蛋白质免疫印迹检测BTF3和细胞自噬等相关蛋白表达水平的变化,q PCR实验检测BTF3 m RNA变化,CCK-8实验研究ZNF281对细胞增殖的影响;在ESCC细胞中进行ZNF281 si RNA敲低,并通过IP实验研究ZNF281对BTF3的翻译后修饰。结果在ESCC细胞中FKBP3敲低下调BTF3的蛋白表达,但不影响其mRNA水平。CHX捕获实验显示,FKBP3敲低导致BTF3的半衰期显著缩短,表明FKBP3能够维持BTF3的稳定性。免疫组化实验结果显示,ESCC组织中BTF3在细胞质中表达上调;BTF3敲低显著抑制ESCC细胞的细胞增殖。通过对蛋白质组学结果的进一步分析和验证,发现FKBP3敲低能够上调m TORC1下游信号通路关键蛋白的表达,显著抑制细胞自噬。BTF3敲低同样能够上调m TORC1下游信号通路关键蛋白的表达,显著抑制细胞自噬。通过对RNA-seq结果的分析和验证,确认了FKBP3敲低上调ZNF281的表达。在ESCC细胞内进行ZNF281敲低,蛋白质免疫印迹结果显示,ZNF281敲低上调BTF3的蛋白表达,而FKBP3表达不受影响,细胞自噬水平上升;q PCR实验结果表明,ZNF281敲低不影响BTF3的m RNA水平;CCK-8实验结果发现,ZNF281敲低能够促进细胞增殖。IP实验显示,ZNF281敲低后BTF3的泛素化水平降低。结论FKBP3通过抑制ZNF281对BTF3的泛素化降解来维持BTF3的稳定,通过靶向BTF3/mTORC1/自噬信号轴促进ESCC细胞增殖。
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