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为了探讨热应激诱发动物免疫抑制的可能机理,本研究以巴马香猪为试验材料,应用实时荧光定量PCR、ELISA、放射免疫和细胞培养等技术,系统分析了:(1)巴马香猪TLR2、TLR4基因和蛋白的分子特征;(2)热应激条件下体内和体外PBMC内参基因的表达稳定性;(3)热应激发生不同时段PBMC TLR2、TLR4 mRNA、血浆皮质醇和IL-2、IL-8表达水平;(4)原代培养的PBMC在热打击后不同时段TLR2、TLR4及其选择性剪接体mRNA和IL-12、IFN-γ表达水平的变化。研究结果如下:(1)巴马香猪TLR2基因开放阅读框长2358 bp,编码785个氨基酸,该蛋白等电点为7.52,分子量为89.48 kD;与普通猪比对发现巴马香猪TLR2基因有15个碱基发生突变;与小鼠、狗、鸡、牛、羊和人的同源性分别为73.4%、82.4%、59.5%、85.3%、84.6%和82.4%;TLR2膜外区蛋白为背侧多个α螺旋和内侧多个β折叠平行交替排列构成一个弯曲状螺旋结构;N末端存在信号肽,且可能在21～22位氨基酸处存在裂解位点;胞外区有4个明显的LRR,分别位于第76～99、360～385、413～432和457～476位氨基酸区;膜外区含6个N连接的糖基化位点。(2)巴马香猪TLR4基因开放阅读框长2526 bp,编码841个氨基酸,该蛋白等电点为6.58,分子量为96.4 kD;与普通猪比对发现巴马香猪TLR4基因有5个碱基发生突变;与小鼠、狗、鸡、牛、羊和人的同源性分别为71.9%、81.5%、54.2 %、86.4 %、85.5%和81.9%;TLR4膜外区蛋白为背侧多个α螺旋和内侧多个β折叠平行交替排列构成一个弯曲状螺旋结构;N末端存在信号肽,且可能在23～24位氨基酸处存在裂解位点;胞外区有13个明显的LRR,分别位于第53～74,77～100,101～124,149～173,174～192,201～225,372～393,398～429,446～469,470～494,495～518,519～541,543～566位氨基酸区;膜外区含8个N连接的糖基化位点。(3)通过RT-PCR验证了TLR4-ASV mRNA的存在。并对其可能编码的蛋白生物信息学分析,结果发现:可能的TLR4-ASV蛋白是一种截短的蛋白质,不存在信号肽结构,不属于非经典分泌蛋白,比正常TLR4蛋白少了6个LRR,存在跨膜结构,胞外结构明显缩短。(4)在热应激条件下,GeNorm和NormFinder分析得出的体内PBMC中6种常用的内参基因的稳定性由高到底依次为:ACTB/RPL> B2M >TBP > 18s RNA > GAPDH和B2M+TBP > B2M > TBP > RPL> ACTB> 18s RNA > GAPDH;体外培养的PBMC中5种常用的内参基因的稳定性由高到底依次为:TBP/B2M> ACTB> RPL> GAPDH和TBP+ACTB> ACTB> TBP> RPL> B2M> GAPDH。(5)在体内模型中,对照组巴马香猪PBMC TLR2 mRNA随应激时间延长,总体变化趋势不大,而应激组PBMC TLR2 mRNA水平有先上升后下降的趋势。相同时间点比较发现,除第一天外,应激组TLR2 mRNA水平明显升高(p<0.05)。而应激组TLR4-All mRNA水平在第1、7、14和21天均极显著高于对照组(p<0.01)。对照组血浆皮质醇浓度总体变化不大,而应激组皮质醇浓度随时间延长有上升的趋势。在热应激第7、14和21天应激组皮质醇浓度显著高于对照组(P<0.05)。对照组血浆IL-2水平呈先上升后下降的趋势,总体上变化并不大。而应激组IL-2水平随时间延长有上升趋势。在热应激的第1天、第7天应激组IL-2水平显著低于对照组(P<0.05)。IL-8无论在应激组或对照组都有下降趋势,但同一时间点两者差异不显著(P>0.05)。(6)在体外模型中,对照组巴马香猪PBMC TLR2 mRNA水平总体变化不大,而热应激组PBMC TLR2 mRNA水平有先上升后下降的趋势。在应激后恢复的第3小时,应激组TLR2 mRNA水平显著提高(p<0.05)且达到峰值。在第6、9小时应激组TLR2 mRNA水平有下降趋势。对照组TLR4-All mRNA水平变化不大,而热应激组TLR4-All mRNA水平有先上升后下降的趋势。且在热应激后恢复的第3和第6小时显著提高(p<0.05),第6小时达到高峰。对照组TLR4-ASV mRNA水平总体趋势变化不大,热应激组TLR4-ASV mRNA水平呈现先上升后下降的趋势。在应激后恢复的第3小时应激组TLR4-ASV mRNA水平极显著提高(p<0.001),且在第6和第9小时均显著高于对照组(p<0.05)。对照组血浆IFN-γ水平随着应激时间的延长有降低的趋势,而热应激组IFN-γ水平有先抑制后恢复的趋势。在热应激后恢复的第1小时热应激组IFN-γ水平显著下降(p<0.05),之后逐渐恢复,到第3、6、9小时与对照组相比,差异均不显著(p>0.05)。对照组血浆IL-12水平总体趋势变化不大,热应激组血浆IL-12水平呈现先上升后下降的趋势。在热应激后恢复的第1小时开始应激组血浆IL-12水平开始上升,到第6小时达到高峰且显著高于对照组(p<0.05),之后开始下降,到第9小时与对照组差异不显著(p>0.05)。结论:(1)成功克隆了巴马香猪PBMC TLR2、TLR4以及TLR4-ASV的mRNA。(2)B2M/TBP和ACTB分别是巴马香猪PBMC体内热应激模型和体外热应激模型中最适合的内参基因。(3)热应激上调了巴马香猪PBMC TLR2 mRNA转录水平,上调了TLR4 mRNA、血浆皮质醇和IL-2表达水平,对IL-8没有明显影响。(4)热应激能刺激体外培养的巴马香猪PBMC TLR2、TLR4、TLR4-ASV mRNA及IL-12表达,但对IFN-γ表达则有抑制作用。