论文部分内容阅读
背景与目的甲状腺癌占所有实体肿瘤的1%,是内分泌系统最常见的恶性肿瘤,也是近年发生率上升最快的恶性肿瘤[1]。其中部分难治性甲状腺癌临床疗效较差,究其原因是肿瘤的侵袭和转移所致。而肿瘤的侵袭及转移是一个多步骤的复杂过程,包括癌细胞通过上皮细胞间质转化(epithelial-mesenehymal transition,EMT),脱离原发瘤体形成局部扩散,侵袭及突破细胞基质,然后进入血管或淋巴管,伴随血液或淋巴到达远处器官或组织,突破血管或淋巴管,最后进入靶器官或靶组织定居、增殖。粘着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)经多年研究被证实为胞内一种重要的信号分子,能够介导胞内信号网络系统的交联,在细胞的增殖、凋亡、黏附、侵袭和转移中起关键的作用。许多研究证实了FAK的表达水平与甲状腺癌分化程度、浸润深度、淋巴结转移、临床分期呈正相关[2,3],可见,如果人为抑制FAK的表达,将有望通过信号传导通路的阻断进而控制肿瘤的转移及扩散。RNA干扰(RNA interference,RNAi)能够特异性剔除特定基因或关闭特定的表达,广泛用于探索基因功能及恶性肿瘤的基因治疗领域。本课题组构建了重组慢病毒pLL3.7-shRNA FAK,感染人转移性大肠癌细胞株SW620,试验表明:其具有满意的转基因效果、表达稳定,且具有满意的抑瘤作用(厦门市科技局资助:3502Z20074007)。基于上述研究,本实验拟应用重组慢病毒pLL3.7-shRNA FAK,感染SW579人甲状腺癌细胞株,利用报道基因绿色荧光蛋白检测转染率并示踪目的基因的表达,通过体内、体外实验,检测相关蛋白表达和增殖情况,探讨其在甲状腺癌治疗中的应用价值。研究方法1.用构建好慢病毒载体pLL3.7FAK shRNA,利用293FT细胞包装成慢病毒,感染SW579细胞,通过报告基因绿色荧光蛋白检测SW579感染效率,利用G418筛选,建立稳定转染目的细胞株。运用Western blot、RT-PCR鉴定FAK的表达情况。2.运用Western blot技术研究FAK shRNA实验组与空质粒阴性对照组及未处理组SW579细胞在E-cad、MMP-2、MMP-9的表达情况。3.将FAK shRNA实验组细胞和空质粒阴性对照组细胞及未处理组细胞注射到裸鼠右腋下,构建肿瘤异体移植模型。研究三组细胞在裸鼠体内的成瘤率及瘤体生长情况方面有无差异。免疫组化检测FAK、E-cad、MMP-2、MMP-9表达情况。结果1.靶向FAK的RNAi慢病毒成功包装,感染率>80%,获得稳定转染人甲状腺癌SW579目的细胞株。RT-PCR、Western blot方法检测发现FAK shRNA实验组细胞与空质粒阴性对照组及未处理组相比,FAK的表达明显降低。2. Western blot方法检测发现FAK shRNA实验组细胞与空质粒阴性对照组及未处理组对比,在E-cad明显增高,而MMP-2、MMP-9的表达明显降低。3.甲状腺癌SW579皮下移植模型构建成功。shRNA介导的FAK基因沉默对甲状腺癌细胞在裸鼠体内的生长有显著影响,但对成瘤率没有明显影响。免疫组化结果证实皮下肿瘤是移植的甲状腺癌细胞成瘤所致FAK shRNA实验组细胞与空质粒阴性对照组及未处理组对比,在E-cad明显增高,而MMP-2、MMP-9的表达明显降低。结论1.获得稳定转染FAK的RNAi SW579细胞。2.体外实验证实FAK干扰可调控侵袭及转移相关蛋白的表达进而抑制肿瘤的表型。3.成功构建甲状腺癌皮下移植模型。体内实验证实FAK沉默明显抑制甲状腺癌细胞SW579生长能力。