作为一种细胞内寄生的机会致病性原虫,在免疫功能正常的宿主体内,弓形虫速殖子增殖受到抑制即转换为缓殖子,形成以包囊形式存在的慢性期感染。包囊可数年甚至终生存在眼和脑内,引起相应的中枢神经系统症状和不同程度的视力损害。缓殖子在宿主免疫功能下降或缺陷时,可重新活化增殖转变为速殖子,造成严重的临床症状和后果,如包囊内缓殖子的激活是艾滋病患者发病和死亡的一个重要原因。因此,预防或控制由包囊内缓殖子引起的慢性感染有着极其重要的意义。目前,弓形虫疫苗保护性抗原的研究大多数针对引起急性感染的速殖子期特异性表达抗原,对引起慢性感染的缓殖子期特异性表达抗原的研究则相对较少。SAG2C/2D/2X是刚地弓形虫SAG2超家族的表面抗原,特异性表达在缓殖子时期,免疫荧光分析表明,SAG2C和／或SAG2D在速殖子-缓殖子转换前即表达。研究发现,SAG2C/2D/2X在包囊长时间存在脑组织的机制中起到重要作用。然而,至今还未有对SAG2C/2D/2X作为抗弓形虫病疫苗的潜力进行评估和检测的研究。因此,以缓殖子期特异性抗原SAG2C/2D/2X为靶抗原的弓形虫核酸疫苗的研究对预防和控制弓形虫慢性感染是非常重要的。在本研究中,我们选择弓形虫缓殖子抗原SAG2C/2D/2X构建核酸疫苗,并评估其诱导小鼠的免疫应答和抗弓形虫包囊形成的保护能力。首先,体外扩增缓殖子抗原SAG2C/2D/2X基因,将其克隆入真核表达质粒pVAX1构建pVAXl-SAG2C (pSAG2C), pVAX1-SAG2D (pSAG2D)和pVAX1-SAG2X (pSAG2X)核酸疫苗,然后将核酸疫苗经肌肉注射免疫BALB/c小鼠。结果表明,与对照组PBS和空载体pVAX1组相比,核酸疫苗免疫组小鼠可产生高滴度的抗弓形虫抗体IgG(d35,p<0.05),特别是pSAG2C, pSAG2X及混合免疫组,IgG抗体滴度在末次免疫后4周增加明显,差异具有显著统计学意义(p<0.01)。ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清细胞因子IL-2的水平在单基因核酸疫苗免疫组较对照组有显著增加(p<0.05),混合免疫组中检测到最高量(486.3±79.1)pg/ml,与单基因组相比差异显著(p<0.01)；流式细胞术分析免疫鼠CD8+T淋巴细胞产IFN-γ的水平,单基因核酸免疫组产IFN-γ的CD8+T淋巴细胞表达较对照组显著增高(p<0.05),混合疫苗免疫组可检测到最高比例的IFN-γ+/CD8+T双染阳性的脾细胞,且具有统计学意义(p<0.01)。淋巴细胞增殖反应也显示,与对照组相比,单基因与混合基因免疫组小鼠的脾细胞具有更高的细胞增殖活性(p<0.05)。以上实验数据表明,单基因及混合基因疫苗诱导小鼠产生主要以Thl型为主的细胞免疫反应。我们用II型弓形虫PRU株包囊进行攻击实验,评估SAG2C/2D/2X核酸疫苗的免疫保护作用。结果显示,核酸疫苗免疫组小鼠脑包囊形成数量显著减少,与PBS组相比其减少率分别为72%,23%和70%,差异具有统计学意义(p<0.05)。特别是pSAG2C/pSAG2D/pSAG2X混合免疫组,包囊减少率达77%,免疫保护性优于单基因免疫组(p<0.01)。我们进一步分析了蛋白SAG2C, SAG2D, SAG2X的结构特性。氨基酸序列比对分数为98%,高度预示SAG2C/2D/2X为同源蛋白；在空间上,发现蛋白SAG2C/2D/2X的结构域由多个β片层环绕而成,预测该结构特点可能与蛋白功能相关。MHC(即H-2)限制性的CD8+T细胞表位肽免疫小鼠可有效刺激小鼠产生免疫应答反应及免疫保护作用。特别是表位肽TSTTKSVTF和QALVPNSSL能高效刺激小鼠记忆性T淋巴细胞增殖,可作为表位疫苗和靶向药物的候选成分。综上所述,本课题通过对编码弓形虫缓殖子期特异性表达抗原SAG2C/2D/2X核酸疫苗及优势表位免疫BALB/c小鼠的实验研究证实,缓殖子抗原SAG2C/2D/2X核酸疫苗可有效诱导免疫鼠产生体液及细胞免疫反应,可有效抵抗弓形虫包囊的攻击,脑内包囊形成数量显著减少,且三种抗原基因混合免疫的效果要优于单基因免疫。另外,筛选出的抗原优势表位免疫小鼠能有效的刺激小鼠记忆性T淋巴细胞增殖,可作为表位疫苗和靶向治疗的有效候选成分,为弓形虫慢性感染的预防和治疗奠定了基础。