自然界高等植物中半数以上物种为多倍体,现为二倍体的物种也常常经历过古老的多倍体化。一般认为,多倍体化加快基因组进化速度,促进新物种的形成。然而,即使是进化速度最快的植物物种,基因组中的突变频率依然很低,很难用常规的方法检测突变类型及其发生频率。了解植物基因组各种突变的频率、多倍体植物基因组的进化特点对深入了解植物进化具有重要意义。本论文利用一个高通量鉴定突变体的方法,详细分析了异源四倍体烟草(Nicotiana tabacum)基因组的稳定性,调查了不同突变类型及估算了突变发生频率。具体研究结果如下:(1)利用一个高通量筛选抗病基因突变体的体系鉴定TMV抗性基因的功能缺失突变体。将纯合转TMV无毒基因P50的烟草,与含有TMV抗性基因N的烟草杂交,获得既含有抗病基因又含有无毒基因的F1杂种,这两个基因的同时表达诱导细胞发生程序性死亡,导致整个发芽幼苗的死亡。但是,当N基因或者P50基因发生功能缺失突变,幼苗不再发生系统性过敏反应,幼苗正常存活。(2)利用这个系统,共筛选了1,400万粒F1杂交种,对存活植株进行分析,鉴定出2,134个F1植株失去对TMV的抗性,突变率为1/6,600。用N基因特异性引物PCR扩增发现除14个突变体外,其它绝大多数突变体中N基因全部序列缺失。用N基因所在染色体的分子标记筛选,发现N基因的侧翼序列也存在不同范围丢失。其中整条染色体丢失的频率为1/15,000,GISH研究表明,这些突变纯合体中只有46条染色体(野生型为48条)。分子标记筛选表明N基因所在染色体部分序列丢失的频率为1/12,000。(3)随机挑选一个N染色体部分缺失突变体N160,分析其序列缺失的机理。利用N基因所在染色体上的分子标记对该突变的纯合体进行筛选,将该突变体序列缺失边界定位在36 bp范围内,用FPNI PCR方法获得缺失区域的替换序列,序列分析发现,N基因所在染色体丢失的部分由它的同祖染色体替换,形成一个嵌合染色体。GISH实验证明嵌合染色体的存在。因此,突变体N160中N基因丢失是由于同祖染色体交换导致的。(4)同祖染色体交换后,分子标记在F2分离群体中表现出4:11:1的分离比例。随机挑选5个染色体部分缺失突变体进行分析,发现均存在接近4:11:1分离比例的分子标记。因此,所有部分染色体缺失突变体都可能是同祖染色体交换引起的,其发生频率为至少1/12,000(有些交换不能被本研究方法鉴定)。(5)染色体不同区域发生同祖染色体交换的频率与该区域发生同源染色体交换的频率不存在线性相关,表明两者存在完全不一样的机制。(6)无论是N基因所在染色体丢失,还是发生同祖染色体交换,都显著降低了这些突变纯合体的生活力。总结,通过本实验室建立的高通量筛选方法,共鉴定了2,134个N基因功能缺失突变体。N基因功能缺失的主要原因是染色体丢失或同祖染色体交换,其频率大大高于点突变及缺失插入突变的频率。同时,与点突变不一样,每一个同祖染色体交换或染色体丢失事件可能改变基因组中106-108碱基。同祖染色体交换及染色体丢失只能在多倍体中产生,二倍体几乎不可能发生这些突变。因此,与二倍体相比,多倍体的基因组可能比二倍体更加不稳定,一方面可能加快物种的灭绝,也可能使多倍体获得更多的多态性,进而在严酷的环境中竞争过二倍体,产生新的物种。