微囊藻毒素(MCs)是一类由淡水蓝藻产生的环状七肽天然毒素,具有强烈的肝、肾毒性。本实验室在前期研究中,率先发现MC-LR染毒后可显著下调雄性小鼠睾酮水平并引发生精功能障碍。生精功能障碍严重影响人类的生活健康,而睾酮分泌不足可导致男性生殖异常、心血管疾病、糖尿病及骨质疏松症等多种病症。因此,探讨MC-LR对雄性生殖系统的损伤,特别是引起睾酮水平显著下调的机制,对评定MC-LR的雄性健康风险具有重要的意义。本实验研究了 MC-LR急性染毒后对雄性小鼠睾丸细胞致凋亡作用的机制;评估了 MC-LR对下丘脑-垂体-睾丸轴激素调节系统的影响,确认了 MC-LR在下丘脑-垂体-睾丸轴激素调节系统的靶位点;进一步探讨了 MC-LR对靶细胞-GnRH神经元产生细胞毒性及影响其功能的分子机制。全文共分为三个部分:第一部分MC-LR急性染毒诱导雄性小鼠睾丸细胞凋亡机制探讨一、目的检测MC-LR急性染毒对雄性小鼠睾丸组织结构细胞凋亡的影响,并探讨MC-LR诱导雄性小鼠睾丸细胞凋亡的机制;建立MC-LR染毒大鼠睾丸间质细胞(Leydigcells)模型,研究MC-LR对间质细胞的影响。二、方法1、Balb/c 雄性成年小鼠腹腔注射 MC-LR(0,3.75,7.5,15,30μg/kg.b.w),连续注射1天,4天后,颈椎脱臼处死小鼠。组织切片观察睾丸组织损伤情况,TUNEL染色检测睾丸组织细胞凋亡情况。2、通过 RT-PCR,检测pp2A,p53,Bcl-2,Bax,Cyt-c,c-jun,c-fos,c-myc,Caspase 3,Caspase 8 表达水平。3、通过 Western Blot,检测 PP2A/p-PP2A,p53/p-p53,Bcl-2/p-Bcl-2,Bax,Cyt-c,Caspase 3水平变化。4、MC-LR(0,1,10,100,250,500,750,1000 nM)染毒大鼠间质细胞 48 h后,取2小时内的细胞培养液检测睾酮浓度,CCK-8法检测细胞活力,FDA-PI双染检测细胞活率,免疫荧光示踪MC-LR检测MC-LR是否进入间质细胞。三、结果1、MC-LR染毒1天后,15和30μg/kg.b.w注射组,睾丸组织出现轻微的结构松散,细胞脱落的状况;MC-LR连续染毒4天后,7.5,15和30μg/kg.b.w注射组,睾丸组织均出现结构松散,细胞脱落的状况;30μg/kg.b.w注射组,曲细精管内可观察到明显的精子数量减少。2、TUNEL检测睾丸组织切片凋亡状况,结果表明,随着染毒剂量的加大和染毒时间的增加,睾丸组织细胞凋亡的比例显著上升。提示MC-LR诱发睾丸细胞凋亡具有时间-剂量依赖性特点。3、RT-PCR结果表明,MC-LR可显著上调凋亡相关分子Bax、caspase3,caspase 5表达水平,增殖相关因子c-myc,c-jun,c-fos表达水平。Western Blot结果表明,MC-LR显著上调p-p53及p-Bcl-2水平。MC-LR对睾丸组织Bcl-2的表达水平没有显著影响。1、MC-LR染毒间质细胞后,细胞培养液中睾酮浓度没有显著变化,细胞活力及活率均没有显著变化;免疫荧光示踪结果表明,MC-LR没有进入间质细胞内部。四、结论1、MC-LR进入睾丸组织后,可诱发睾丸细胞凋亡,结构损伤,继而导致功能障碍。且MC-LR进入组织后,通过与底物PP2A结合,上调磷酸化p53及磷酸化Bcl-2 水平,经由Bax-Caspase通路引发细胞凋亡。2、MC-LR对睾酮合成细胞-间质细胞无细胞毒性,不改变其合成睾酮的能力。第二部分MC-LR对下丘脑-垂体-睾丸轴激素轴的影响及作用靶点一、目的建立MC-LR染毒Balb/c小鼠、SD大鼠模型,检测不同浓度MC-LR连续作用对下丘脑-垂体-睾丸轴的影响,评估MC-LR雄性内分泌毒性。鉴定MC-LR在下丘脑、垂体组织中的分布;通过添加GnRH抑制剂或GnRH,确定MC-LR在下丘脑-垂体-睾丸轴的作用靶点。二、方法1、Balb/c雄性成年小鼠腹腔注射MC-LR(0,3.75,7.5,15,30μg/kg.b.w),连续注射1天,4天,7天,14天后,摘眼球取血,颈椎脱臼处死小鼠。检测小鼠体重变化,检测血清LH、FSH、睾酮变化;RT-PCR检测下丘脑-垂体-睾睾 中主要分子 Kiss-1,GPR54,GnRH,GnRHr,LHβ,FSHβ,LHr,FSHr表达变化。2、检测MC-LR对SD大鼠的LD50剂量。基于LD50,成年SD大鼠腹腔注射MC-LR30μg/kg.b.w,续注射1,3,5,7,14天后,眼球取血,颈椎脱臼处死小鼠。利用放免法检测血清中GnRH、LH、FSH及睾酮水平;TUNEL法鉴定下丘脑细胞凋亡情况。3、MC-LR腹腔注射SD雄性大鼠(100μg/kg.b.w),动物瀕死前颈椎脱臼处死。Western Blot鉴定MC-LR是否进入下丘脑和垂体组织。免疫荧光共定位检测MC-LR是否进入下丘脑GnRH神经元。4、体外培养GT1-7细胞系,免疫荧光染色GPR54和GnRH鉴定细胞。1000nM MC-LR染毒GT1-7细胞24小时后,免疫荧光鉴定MC-LR是否进入细胞内。5、成年SD大鼠皮下注射西曲瑞克(0.313,0.625,1.25mg/kg.b.w)12小时,检测LH、FSH转录及血清睾酮水平变化,选择最有效作用浓度。6、基于上述实验中,成年SD雄性大鼠腹腔注射MC-LR 30 μg/kg.b.w 5天后血清中GnRH到达峰值,给予给药动物补注射GnRH抑制剂西曲瑞克;基于预实验中SD雄性大鼠腹腔注射MC-LR 30 μg/kg.b.w 14天后,GnRH水平显著下降,给予给药动物补注射GnRH。摘眼球取血,检测血清中LH、FSH和睾酮水平变化,判断GnRH是否为MC-LR作用后,血清LH、FSH和睾酮变化的使动因素。三、结果1、Balb/c 雄性成年小鼠腹腔注射 MC-LR(0,3.75,7.5,15,30 μg/kg.b.w)1,4,7天后,小鼠体重没有发生显著变化;注射14天后,30μg/kg.b.w组小鼠体重显著下降。注射1天时,30μg/kg.b.w组小鼠血清LH、睾酮均上升;注射4天后,15μg/kg.b.w组小鼠血清LH、FSH及睾酮水平也发生上升;而注射7天后,30 μg/kg.b.w组小鼠血清LH、FSH及睾酮出现轻微下降;注射14天后,所有MC-LR注射小鼠血清LH及睾酮显著低于正常水平。RT-PCR结果显示,MC-LR染毒没有改变Kiss-1,GPR54,GnRHr,LHr,FSHr的表达水平;LHβ,FSHβ的表达水平与血清呈相同趋势,但GnRH表达水平随着MC-LR染毒浓度和作用时间的加强,显著降低。2、SD雄性大鼠腹腔注射MC-LR 30μg/kg.b.w染毒1,3,5天时,血清中GnRH、LH、FSH、睾酮均呈现上升趋势,第五天达到峰值;染毒7,14天时,血清中GnRH、LH、FSH和睾酮均迅速下降,且4种激素变化趋势一致。TUNEL法鉴定发现,MC-LR染毒1,3,5天时,没有观察到显著的凋亡变化,而染毒7,14天时,可观察到下丘脑弓状核和室前核明显的细胞凋亡。3、MC-LR腹腔注射SD雄性大鼠(100 μg/kg.b.w)后,Western Blot检验结合在PP蛋白上的MC-LR,结果表明MC-LR进入下丘脑组织,不进入垂体组织。下丘脑组织连续切片,通过免疫荧光示踪,荧光标记免疫MC-LR及GnRH,结果可观察到下丘脑存在MC-LR和GnRH双阳性的细胞,即MC-LR可有效进入下丘脑GnRH神经元。4、免疫荧光标记GPR54和GnRH,观察到细胞系双阳性,证明该细胞为GT1-7细胞,具有合成GnRH的能力。免疫荧光标记MC-LR表明,MC-LR可有效进入GT1-7细胞。5、通过检测LH、FSH转录水平和血清睾酮水平,认为西曲瑞克腹腔注射0.625 mg/kg.b.w12小时后,对LH、FSH及血清睾酮水平抑制最为显著。6、成年SD雄性大鼠腹腔注射MC-LR30 μg/kg.b.w 5天后,给药动物补注射GnRH抑制剂后,可观察到血清中LH、FSH和睾酮均恢复到正常水平;7、成年SD雄性大鼠腹腔注射MC-LR 30 μg/kg.b.w 14天后,给药动物补注射GnRH,可观察到血清中LH、FSH和睾酮恢复到正常水品。四、结论MC-LR在下丘脑-垂体-睾丸轴的作用靶点为GnRH神经元,可导致GnRH转录水平的显著下降,并导致GnRH释放水平先升高后下降,进而引发LH、FSH、睾酮水平同步先升高后下降。第三部分MC-LR对GT1-7细胞毒性和合成及分泌GnRH影响的分子机制一、目的建立GnRH神经元细胞系(GT1-7 cells)模型,研究MC-LR对GT1-7细胞的影响;探索MC-LR对GT1-7细胞产生毒性的分子机制;探索MC-LR影响GT1-7细胞合成及分泌GnRH的分子机制。二、方法1、MC-LR(0,1,10,100,1000,10000nM)染毒 GT1-7 细胞 48h 后,CCK-8法检测细胞活力,LDH法检测细胞膜泄露率,TUNEL法检测细胞凋亡状况。2、MC-LR1000nM染毒GT1-7细胞48 h后,采用凋亡抗体芯片技术筛选明显变化的蛋白,Q-PCR法验证阳性蛋白。3、MC-LR(0,1,10,100,1000,10000nM)染毒 GT1-7 细胞 48h 后,取 2小时内的细胞培养液检测GnRH浓度,Q-PCR法检测GnRH转录水平变化。Elisa法检测细胞cAMP、Ca2+浓度,Elisa法检测细胞AC的活力变化;Q-PCR法检测GnRH转录因子Oct-1、Otx2、Pbx1α、Dlx2、Fos和Jun的表达变化。三、结果1、CCK-8及LDH结果表明,随着MC-LR作用浓度升高,细胞活力显著下降,LDH显著上升;TUNEL法检测细胞凋亡发现,MC-LR可显著诱导GT1-7细胞凋亡。2、凋亡芯片结果表明,部分凋亡相关蛋白Bax、Bid表达上调,Bcl-2、Bcl-w、p53、IGF-2、IGFbp-2、IGFbp-4、IcIAP-2、sTNF-R1 和 sTNF-R2 表达下调。Q-PCR 检验其中 Bcl-2、p53、IGF-2、IGFbp-2、IGFbp-4,结果与凋亡芯片结果相符。3、MC-LR染毒GT1-7细胞后,可观察到细胞培养液中GnRH浓度随MC-LR作用浓度的升高,呈先升高后下降的显著趋势;Q-PCR结果表明,GnRH转录水平随着MC-LR作用浓度升高显著下降。细胞内cAMP、Ca2+显著上调,AC活力显著上调。转录增强子Oct-1、Otx2、Pbx1a、Dlx2显著下调,转录抑制因子fos显著上调,jun显著下调。四、结论1、MC-LR对GT1-7细胞具有强烈毒性,可通过下调bcl-2、bcl-w、p53、IGF-2、IGFbp-2、IGFbp-4、IcIAP-2、sTNF-R1 和 sTNF-R2,上调 bax 和 bid 诱发细胞凋亡。2、MC-LR 可下调 GnRH 转录激活因子 Oct-1、Otx2、Pbx1a、D1x2,上调 GnRH转录抑制因子c-jun水平,进而引发GnRH转录水平显著下降。3、MC-LR显著上调细胞内Ca2+水平,激活AC,引发cAMP显著增多,刺激GnRH释放增加,并最终由于GnRH转录水平下降,GnRH释放水平继而下降。