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母源抗体传递给新生动物对于其刚出生时期的健康十分重要,偶蹄类动物主要是通过初乳中高含量的IgG传递给后代,从而达到对后代的被动免疫的作用。关于初乳中高IgG含量的形成机理至今还不是很清楚,牛Fc受体(bFcRn)是能结合IgG的一种主要的受体,它被认为参与了这个过程,因此研究牛Fc受体在乳腺组织中的功能显得十分重要。同时从普通牛奶中分离的牛源抗体是很好的人源抗体代用品,进一步了解bFcRn的作用机制,为生产高免疫球蛋白含量的牛奶——初乳化牛奶和开拓新的乳品质改良的新方法打下坚实的基础。本研究主要侧重在牛Fc受体在乳腺组织中对于IgG的作用,构建了在乳腺组织特异表达的牛Fc受体表达载体,利用显微共注射的方法制备了转基因小鼠,研究了多拷贝整合对于外源基因表达的影响,检测了泌乳期小鼠乳中和血液中IgG的水平。通过尾静脉注射人工IgG研究了在泌乳期人IgG在小鼠体内的代谢情况,注射等量的牛IgG1和IgG2研究了转基因小鼠在泌乳期对于牛IgG亚型的不同转运作用。
通过共显微注射得到了10只转基因阳性小鼠,其中8只双亚基整合,2只单亚基整合。由于部分种公鼠采用的是能在乳腺特异表达人单抗的转基因小鼠,我们同时还得到了3只四链整合的转基因小鼠,即抗体的重链和轻链,还有牛Fc受体的大亚基和小亚基。通过Southern杂交鉴定了所有的转基因小鼠都具有完整的启动区结构,而且转基因大亚基的拷贝数为1-15,小亚基的整合拷贝数为1-10,大亚基和小亚基的整合拷贝数并不成比例,都是随机整合的。转基因小鼠乳腺组织的RT-PCR证明了牛Fc受体在RNA水平的正确表达,Nor thern杂交证明了牛Fc受体表达的组织特异性,即牛Fc受体的大亚基只在泌乳期转基因小鼠的乳腺组织中表达。而且对于F1代转基因小鼠的表达分析结果显示转基因结构能稳定的遗传到后代中,但是同时我们也观察到了大亚基和小亚基在后代中的分离,特别是四链整合的转基因小鼠,后代中很少再有四链整合的小鼠。定量PCR检测了不同转基因系牛Fc受体表达的水平差异,牛Fc受体大亚基表达水平的高低基本与其转基因拷贝数相关。牛Fc受体的过量表达并没有影响到鼠内源FcRn受体的表达,鼠FcRn受体的表达在各个转基因系间没有明显的差别。我们检测了泌乳中期转基因小鼠乳中和血液中的IgG变化,发现各个转基因小鼠乳汁中的IgG含量比非转基因小鼠有明显的提高,而乳中IgA的含量却没有明显的差异,这说明乳中免疫球蛋白含量的变化是IgG特异性的,同时相应的转基因小鼠血液中的IgG含量也有提高。
注射人IgG作为示踪抗体,研究了人IgG在泌乳期转基因小鼠中的代谢,发现人IgG在转基因小鼠体内的半衰期比野生型小鼠延长了2-3倍,而且单亚基整合的转基因小鼠体内人IgG的半衰期要比双亚基整合的转基因小鼠的要长。泌乳期乳中的免疫球蛋白绝大部分都是来源于血液中,所以正是由于小鼠体内IgG半衰期的延长导致了血液中IgG的累积,从而同时导致了乳中IgG含量的增加。给转基因小鼠注射等量牛IgG1和IgG2后,IgG1的转运与bFcRn的表达并没有很大关联,而IgG2的转运受到了bFcRn的影响更多,即IgG2被更多的留在了血液中。