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绝经后骨质疏松(Postmenopausal osteoporosis，PMO)是以绝经后骨量减少、骨微结构受损，导致骨脆性增加为特征的骨代谢性疾病。成骨细胞(osteoblast，OB)骨形成与破骨细胞(osteoclast，OC)骨吸收间的动态平衡构成了骨重建过程。自然绝经或去势手术后女性由于性激素缺乏导致骨丢失增加，骨质疏松症(osteoporosis)发生率高于同龄男性。PMO最主要与性激素紊乱及免疫失调密切关联。迄今为止，治疗PMO的方法主要是预防骨吸收。绝经后女性普遍应用的雌激素替代疗法也主要作用于骨吸收，但近来对长期运用雌激素治疗的安全性提出了质疑。作为骨形成细胞，OB在PMO的病理生理学及其导致的严重并发症—骨折中起关键作用。因而改善OB合成代谢的药物将是更有前景的围绝经期防治策略。脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone，DHEA)是体内最丰富的肾上腺甾体激素前体，其生物学功能并不能完全归结于其代谢产物。近年研究发现，绝经后女性的DHEA水平低于正常人群，并主张应用DHEA治疗PMO。但DHEA对骨代谢效应的生化和分子机制尚未阐明。近来研究提示中医药作为骨形成诱导药物具有良好前景。我们的补肾宁心方(Bushen Ningxin Decoction，BSNXD)，具有补。肾宁心作用，能有效地防治PMO。本研究拟通过如下体内外实验，以解析DHEA和BSNXD对OB增殖、凋亡及免疫功能的调控作用，以阐明DHEA和BSNXD防治PMO的分子机制。第一部分脱氢表雄酮对成骨细胞-免疫网络的调控作用目的探讨DHEA对骨组织形态、OB增殖和凋亡以及CD4~+T细胞Th1/Th2型细胞因子及协同刺激分子表达的调控作用；以及干预雌激素和雄激素受体信号及MAPK信号途径对DHEA效应的影响。方法建立BALB/c小鼠PMO模型，分为OVX组、OVX+DHEA组、OVX+E2组，另设Sham组为假手术对照。取腰椎和股骨行骨组织形态计量分析；并取椎骨植块法培养OB，流式细胞术(FCM)分析增殖细胞核抗原(PCNA)表达；FCM检测各组鼠脾脏CD4~+T细胞内IL-2、IFN-γ(Th1型)和IL-4、IL-10(Th2型)的表达。颅骨酶解法原代培养鼠OB，在有或无DHEA存在的情况下，透射电镜观察DHEA对OB超微结构的影响；原代OB以雌激素受体(ER)拮抗剂ICI 182，780、雄激素受体(AR)拮抗剂Flutamide或U0126预处理后给予系列浓度DHEA或E2孵育，FCM分析OB DNA含量，Annexin V-FITC/PI双标记FCM分析细胞早期凋亡，Western blotting分析OB ERK1/2磷酸化状态；原代OB分别给予系列浓度DHEA或E2处理，实时定量RT-PCR和Western blotting分析OB芳香化酶、ERα、ERβ和AR mRNA转录及蛋白表达水平；颅骨酶解法培养鼠OB；MACS法分离CD4~+T；将OB或CD4~+T分别以溶媒、ICI 182，780、Flutamide或CsA预处理后，予以DHEA或E2培养并以LPS刺激；以FCM分析OB表面CD80、CD86以及CD4~+T细胞表面CD28、CTLA-4表达。结果OVX组与Sham组相比，椎骨和股骨骨小梁面积显著下降(P＜0.01)，说明PMO模型成功建立；与OVX组相比，OVX+DHEA组及OVX+E2组腰椎、股骨骨小梁面积都明显增加(P＜0.01)。透射电镜可见经DHEA诱导后的OB细胞器明显增多，内质网扩张，线粒体丰富等形态学改变。OVX组OB的PCNA表达与Sham组相比显著增高(P＜0.05)；与OVX组相比，OVX+DHEA组OB核内PCNA的平均荧光强度和阳性细胞百分率皆显著增高(分别为P＜0.05和P＜0.01)；DNA含量分析显示，DHEA组的S期和G2/M期细胞百分率比对照组明显增加，G0/G1期细胞百分率明显下降，细胞增殖指数(PI)显著增加(P＜0.01)，而E2对OB细胞周期无显著影响；DHEA和E2可显著抑制血清饥饿诱导的OBs早期凋亡(分别为P＜0.01和P＜0.05)，并诱导OB中ERKs的磷酸化(P＜0.01)；U0126而非ICI 182，780或Flutamide能有效地阻滞DHEA的上述效应，而E2对OB凋亡及ERKs磷酸化的效应可被ICI 182，780或U0126而非Flutamide所阻滞。OB中稳定表达芳香化酶、ERα、ERβ和AR mRNA及蛋白。与对照组比较，DHEA和E2显著增加芳香化酶mRNA、ERα和ERβmRNA及蛋白表达水平(分别为P＜0.01和P＜0.05)；DHEA显著提高了ERβ/ERα比值；而E2则显著降低了ERβ/ERα比值(P＜0.05)；且DHEA而非E2可显著增加OB中芳香化酶、AR mRNA和蛋白表达水平(P＜0.01)。经LPS刺激后，DHEA及E2组OB表达CD80、CD86(平均荧光强度和阳性细胞百分率)显著增加(分别为P＜0.05和P＜0.01)；CsA可显著降低对照组及DHEA处理组受LPS刺激后OB表面CD80、CD86的表达(P＜0.01)，而ICI 182，780或Flutamide则无此效应；但E2对OB表面CD80、CD86表达的影响可被CsA或ICI 182，780而非Flutamide抑制。OVX组脾脏CD4~+T细胞内Th1型细胞因子(IL-2、IFN-γ)表达显著低于Sham组(P＜0.05)；而OVX+DHEA组和OVX+E2组显著高于OVX组(分别为P＜0.01和P＜0.05)。同时，OVX+DHEA组Th2型细胞因子(IL-4、IL-10)表达显著低于OVX组(P＜0.01)。OVX组IFN-γ/IL-4比值明显低于Sham组(P＜0.05)；OVX+DHEA组和OVX+E2组IFN-γ/IL-4比值均显著高于OVX组(P＜0.01)；且OVX+DHEA组OB PCNA表达与CD4+T细胞IFN-γ水平呈明显正相关(相关系数r=0.931，P＜0.05)；与IL-4水平呈负相关(r=-0.815，P＜0.05)。无论有无LPS刺激，E2组CD4~+T细胞表面CD28和CTLA-4(平均荧光强度和阳性细胞百分率)表达无显著改变(P＞0.05)；DHEA组在LPS刺激后CD4~+CD28~+T细胞百分比增加(P＜0.05)，而CD28，CTLA-4的平均荧光强度及CTLA-4的阳性细胞百分率无显著改变(P＞0.05)。结论DHEA可显著改善骨形态，并有效促进OB合成代谢有关的细胞器增加。DHEA经ER或AR非依赖途径促进OB增殖并抑制其凋亡，提示它可能直接经DHEA特异性受体发挥效应，而并非经转化为雄激素或雌激素后发挥作用；磷酸化ERK1/2参与介导这一作用。DHEA显著增加OB芳香化酶表达，有助于增加骨组织局部雌激素浓度；DHEA可显著增加鼠OB ERα、ERβ和AR水平，使OB对雌激素等配体的反应性增加。DHEA在体外经ER或AR非依赖途径，上调受LPS刺激的鼠OB协同刺激分子CD80、CD86表达，该作用可被CsA阻滞；DHEA可显著升高CD4~+T细胞Th1型细胞因子并降低Th2型细胞因子表达，形成Th1型免疫偏移，从而显著改善PMO的免疫状态；DHEA还可上调CD4~+T细胞CD28的表达，提示可改善骨—免疫调节网络。第二部分补肾宁心方对成骨细胞-免疫网络的调控作用目的探讨BSNXD对骨组织形态、OB增殖和凋亡以及CD4~+T细胞Th1/Th2型细胞因子及协同刺激分子表达的调控作用；并探讨干预雌激素和雄激素受体信号以及MAPK信号途径对中药血清效应的影响。方法建立BALB/c小鼠PMO模型，分为OVX组、OVX+BSNXD组、OVX+DHEA组、OVX+E2组。另设Sham组为假手术对照。取腰椎和股骨行骨组织形态计量分析；并取椎骨植块法培养OB，FCM分析PCNA表达；FCM检测各组鼠脾脏CD4~+T细胞内IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的表达。颅骨酶解法培养OB，在对照鼠血清或中药血清存在的情况下，透射电镜观察BSNXD药物血清对OB超微结构的影响。原代OB以ICI 182，780、Flutamide或U0126预处理后给予系列浓度对照鼠血清或中药血清孵育，FCM分析DNA含量，Annexin V-FITC/PI双标记FCM分析细胞早期凋亡；原代OB分别予以5-30％系列浓度的对照鼠血清或中药血清培养，实时定量RT-PCR分析OB芳香化酶、ERα、ERβ和AR mRNA转录水平；颅骨酶解法培养鼠OB，MACS法分离CD4~+T；将OB或CD4~+T分别以溶媒、ICI 182，780、Flutamide或CsA预处理后，予以系列浓度对照鼠血清、中药血清或E2培养并以LPS刺激；以FCM分析OB表面CD80、CD86以及CD4~+T细胞表面CD28、CTLA-4表达。结果与OVX组相比，OVX+BSNXD组腰椎、股骨骨小梁面积明显增加(P＜0.05)。透射电镜可见经20％药物血清诱导后的OB呈现典型的细胞器明显增多，内质网扩张，线粒体丰富等形态学改变。与OVX组相比，OVX+BSNXD组OB核内PCNA的平均荧光强度和阳性细胞百分率皆显著增高(P＜0.05)；DNA含量分析显示与相应对照组相比，10-20％药物血清组的S期和G2/M期细胞百分比明显增加，G0/G1期细胞百分比明显下降，PI显著增加(分别为P＜0.05和P＜0.01)；10-20％的药物血清还可显著抑制血清饥饿诱导的OBs早期凋亡(分别为P＜0.05和P＜0.01)；U0126，ICI 182，780或Flutamide都只能部分地阻滞BSNXD药物血清的上述效应。与相应对照组比较，10-20％BSNXD药物血清显著增加OB中芳香化酶、ERα、ERβ和AR mRNA表达水平(分别为P＜0.01和P＜0.05)，且20％BSNXD药物血清显著提高了ERβ/ERα比值(P＜0.01)。经LPS刺激后，BSNXD药物血清OB表达CD80、CD86(平均荧光强度和阳性细胞百分率)显著增加(P＜0.01)；CsA可显著降低对照组及中药血清组受LPS刺激后OB表面CD80、CD86表达(P＜0.01)，而ICI 182，780或Flutamide则无此效应。OVX+BSNXD组脾脏CD4~+T细胞内Th1型细胞因子(IL-2、IFN-γ)表达显著高于OVX组(P＜0.05)。同时，OVX+BSNXD组Th2型细胞因子(IL-4、IL-10)表达显著低于OVX组(P＜0.05)。OVX+BSNXD组IFN-γ/IL-4比值均显著高于OVX组(P＜0.01)。且OVX+BSNXD组OBPCNA表达与CD4+T细胞IFN-γ水平呈明显正相关(相关系数r=0.943，P＜0.05)，与IL-4水平呈负相关(r=-0.934，P＜0.05)。无论有无LPS刺激，BSNXD药物血清组CD4~+T细胞表面CD28和CTLA-4表达无显著改变。结论BSNXD可有效促进OB增殖，显著改善骨形态。BSNXD药物血清在体外可经ER和AR等依赖途径促进OB增殖并抑制其凋亡，提示BSNXD在小鼠体内代谢新生的内生性成分含有ER和AR信号通路中的活性物质；多种信号转导途径包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径，磷酸化ERK1/2参与介导这一作用。BSNXD药物血清显著增加OB芳香化酶转录，有助于增加骨组织局部雌激素浓度；BSNXD药物血清还可显著增加鼠OB ERα、ERβ和AR转录，使OB对雌激素等配体的反应性增加。BSNXD药物血清在体外经ER或AR非依赖途径上调受LPS刺激后OB CD80、CD86表达，该作用可被CsA阻滞；BSNXD可显著升高Th1型细胞因子并降低Th2型细胞因子表达，形成Th1型免疫偏移，从而显著改善PMO的免疫状态，从而显著改善骨免疫内环境。因此，BSNXD与DHEA联合应用可能是一种更理想的PMO防治方案。