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实验背景和目的:胃癌(Gastric carcinoma,GC)是导致癌症相关性死亡的第三大疾病,有关胃癌治疗的技术手段,虽然进步迅速,但依然患者预后差的主要原因就是复发后转移及耐药机制的形成。而缺氧可诱发肿瘤转移及化疗耐药。在此过程中,上皮细胞间质化(Epithelial-mesench ymal transition, EMT)被认为是转移的起始环节。本研究旨在高通量测序,细胞实验和临床标本验证三个层面探讨c-MET介导的上皮间质转化在胃癌获得性化疗耐药中的作用及机制。实验方法:通过观察细胞形态,检测并比较上皮及间质标志的表达水平、EMT相关转录因子ZEB1的表达、侵袭和迁移实验、明确获得性耐药细胞的EMT进程;利用shRNA下调耐药珠ZEB1的表达,比较两组之间的各个参数的影响变化;检测两组细胞系中HGF表达、c-MET表达及扩增;利用c-MET抑制剂、下调c-MET表达;临床收集一线奥沙利铂化疗失败的患者组织样本,检测HGF、c-MET、EMT标志物表达及c-MET扩增的变化,结合临床资料分析c-MET、EMT标志物与化疗疗效的关系;采用标准Illumina测序平台实验操作流程对各3例细胞系进行总RNA提取、建立样本文库和高通量测序工作;测序后数据采用标准质控过滤原始数据,通过对分组样本比较结合KEGG等数据库综合生物信息分析,得到耐药细胞特有表达基因及参与调控的miRNA、lcRNA和环状RNA等调控元件;构建共表达网络图,检测耐药系与亲代系之间的差异基因表达;得到基于microRNA-ce RNA-mRNA的耐药性空间调控网络。实验结果:1.建立人胃癌奥沙利铂耐药细胞系2耐药系在实验过程中发生EMT,且c-MET呈过表达。3 c-METsiRNA能够抑制胃癌奥沙利铂耐药SGC-7901/L-OHP细胞EMT。4.通过标准Illumina流程测序后,LOP7901和SGC-7901各3例样本均得到不少于10G原始数据Q20比例大于95%,Q30比例大于90%。符合测序指控要求。生物信息分析后:mRNA得到61139条,lncRNA30048条,circRNA1269条。5.通过细胞系组间均一化后进行2组差异表达比较,共得到2340条差异表达的调控元件,其中上调926条,下调1414条。6.通过对分组表达差异基因和表达差异调控元件注释及聚类分析,我们共得到GO上调机制309个,下调机制205个;上调KEGG通路30个,下调通路20个。通过进一步对胃癌、耐药性、奥沙利铂为关键词进行筛选分析最终得到Protein phosphatases and associated proteins 通路。7.通过对调控元件和差异表达基因共表达协同分析,我们得到了围绕HGF基因、GDF15基因和HMCN2基因的共表达空间调控网络,该网络可能为胃癌细胞耐药的主要调控机制。8.E-cadherin、N-cadherin、Vimentin及C-MET在耐奥沙利铂的胃癌与不耐药的胃癌呈差异性表达,三者的相互影响、形成和转移及其在耐药上有一定的联系。实验结论:1.建立人胃癌奥沙利铂耐药细胞系2.耐药系在实验过程中发生EMT,且c-MET呈过表达。3.实验细胞系通过全转录组高通量测序得到了以phosphatases and associated proteins通路为核心的基因表达变化机制。4.通过对调控元件和差异表达基因共表达协同分析,我们得到了围绕HGF基因、GDF15基因和HMCN2基因的共表达空间调控网络。