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沙门氏菌鞭毛蛋白是构成菌体鞭毛的单体蛋白,它不仅是细菌运动和黏附的重要组成原件,也是天然Toll样受体5 (Toll-like receptor, TLR)的激动剂,能够与TLR5结合激活MyD88信号途径,引起IL-8等细胞因子分泌增多,增强免疫细胞分化增殖等效应。虽然其本身具有沙门氏菌H抗原表位区域,却不影响其佐剂作用的发挥,甚至可作为自身佐剂增强鞭毛的抗原性,因此,自1998年其佐剂作用被发现以来,一直是疫苗免疫增强剂的研究热点,多项研究显示鞭毛蛋白能够增强原核和真核表达蛋白抗原的抗原性,通过对天然免疫因子的调节增强特异性免疫应答。干酪乳杆菌是安全级微生物(generally regarded as safe,GRAS)的益生菌,因其菌体成分和分泌物能够明显促进黏膜和体液免疫,亦是疫苗佐剂候选者。本研究利用重组鞭毛蛋白的免疫增强作用,通过以传染性法氏囊病毒(IBDV)为抗原模型,探讨了鞭毛蛋白对不同形式疫苗的免疫增强作用,结合干酪乳杆菌外源蛋白表达系统无毒素残留、菌体及分泌成分具有益生作用的优势,以期获得纯化步骤简单、易于生产的重组鞭毛蛋白作为疫苗免疫佐剂的候选者。利用PCR方法以鼠伤寒沙门氏菌菌体为模板获得鞭毛蛋白B亚单位基因(FliB),碱基序列经对比与GenBank上已公布序列NC 003197.1完全一致。有应用重叠延伸PCR (SOE-PCR)方法去掉FliB的高变区(171aa-407aa),只保留氨基端和羧基端的保守序列,并插入柔性肽序列和酶切位点,获得截短的鞭毛蛋白FliBc,建立能够便捷插入不同抗原的免疫增强剂基因模型。将FliB和FliBc基因连接乳酸菌载体pPG-2载体构建重组干酪乳杆菌pPG-2-FliB/L.casei 393和pPG-2-FliBc/L.casei 393,诱导表达后获得分子量分别为53 kD和35 kD的分泌型重组蛋白,在体外检测其对人结肠癌上皮细胞Caco-2的TLR5刺激活性,结果显示细胞内IL-8表达量明显升高,说明表达的重组蛋白FliB和FliBc在体外具有生物活性,并且在培养条件相同情况下,单位体积内pPG-2-FliBc/L.casei 393培养上清中蛋白的TLR5刺激活性强于pPG-2-FliB/L.casei 393.首先,为了检验截短后的FliBc表达的蛋白对VP2抗原是否有增强免疫的作用,将IBDV保护性抗原VP2基因插入重组质粒pProHTa-FliBc中,用大肠杆菌表达系统表达出VP2-FliBc融合蛋白,并与其他两种形式蛋白(单纯表达的VP2蛋白,分别表达的重组蛋白VP2 和 FliBc机械混合)分别加入弗氏佐剂制备出亚单位疫苗模型,免疫SPF雏鸡后检测各项指标,探讨构建的FliBc是否能够增强插入抗原引起的免疫反应,以及融合和混合与抗原配合使用的效果。检测免疫鸡血清中IgY效价,嵌合蛋白VP2-FliBc组明显显著高于VP2+FliBc混合组和VP2组,MTT法检测脾淋巴细胞增殖能力也明显高于VP2组,攻毒保护率较对照组也有所上升。证明FliBc与VP2抗原蛋白融合后免疫发挥了明显的免疫增强作用,也进一步验证前人的结论:FliBc与抗原融合表达免疫效果强于与抗原机械混合,因为FliBc在与抗原连接时能够更好的提呈抗原从而增强其特异性免疫应答。为探索鞭毛蛋白与活毒疫苗配合使用的免疫效果,本试验选用IBDV商品化弱毒疫苗(D78株)作为抗原模型,选用肌注(im)和滴鼻(in)两种方式免疫,分别与总蛋白含量相同的重组菌pPG-2/L.casei 393、pPG-2-FliB/L.casei 393和 pPG-2-FliBc/L.casei 393上清共同免疫7日龄SPF雏鸡,只免疫一次。每周采血直至56日龄,检测免疫后血清中IBDV特异性IgY效价,结果显示两种途径pPG-2-FliBc/L.casei 393上清组均具有最高效价,并且在49日龄免疫后SPF鸡用IBDV超强毒株(vvIBDV)进行攻毒,计算免疫保护率也明显高于对照组。pPG-2-FliB/L.casei 393组也显示一定免疫增强作用,但效果不及截短的FliBc上清组。横向比较肌注免疫途径与滴鼻免疫途径,肌注方式的体液和细胞免疫应答强度均高于滴鼻组,但检测泪液和肠道粘液中的分泌型IgA (slgA)水平,in组显著高于im组,说明鞭毛蛋白在黏膜途径免疫中具有够增强局部免疫的功能。检测免疫后血清中和抗体效价,im组整体水平高于in,最高中和效价达1：100以上；相同免疫途径组内比较pPG-2-FliBc/L..casei 393组显著高于对照组,而pPG-2-FliB/L.casei 393组与对照组差异不显著。FliBc作为IBDV VP2基因乳酸菌活载体疫苗免疫增强剂的评价：将VP2-FliBc基因与pPG-2连接转化干酪乳杆菌L.casei 393, 用 Western-blotting方法检测重组菌体和培养上清,均表达与预期相符的分子量约为76 kD的重组蛋白。将诱导后菌体培养至1010CFU/mL, pPG-2-VP2-FliBc/ L.casei 393和本实验室构建好的pPG-2-VP2/L.casei 393,以及对照组pPG-2/L.casei 393分别经口服途径免疫SPF雏鸡,并间隔10 d加强免疫两次,检测血清IgY特异性抗体效价,pPG-2-VP2-FliBc/ L.casei 393组高于pPG-2-VP2/L.casei 393组；并且脾淋巴细胞增殖指数和攻毒后保护率也均高于pPG-2-VP2/L.casei 393组。说明在1BDV VP2干酪乳杆菌活载体基因疫苗中插入FliBc基因,能够增强动物的体液和细胞免疫应答,具有免疫增强活性。综上所述,本研究建立了表达沙门氏菌全长鞭毛蛋白FliB和截短鞭毛蛋白FliBc的E.coli和干酪乳杆菌表达系统并正确表达了两种蛋白,通过L.casei 393表达的两种重组蛋白体外活性比较,显示截短的FliBc的TLR5刺激活性强于FliB。同时建立三种形式IBDV疫苗模型：VP2亚单位疫苗、商品IBDV弱毒疫苗和VP2基因的乳酸菌活载体疫苗,将FliBc分别以蛋白和基因融合表达形式与三者配合使用,检测血清IgY、黏膜IgA及免疫保护试验评价免疫效果,说明FliBc无论在三种疫苗免疫中均发挥了增强体液和细胞免疫的作用,具有开发为免疫佐剂的潜能。