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动物细胞的体外培养已被广泛运用于细胞和分子生物学领域。小肠是食物进行消化吸收的主要场所,而小肠黏膜上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IEC)是肠道主要的功能细胞,参与肠道食糜的消化、吸收、免疫屏障和应激反应等,并与肠道的内、外分泌功能有密切联系。体外培养小肠黏膜上皮细胞技术成为深入研究小肠功能和病原微生物致病机理的重要技术平台。本研究使用多种酶消化法及组织块培养法尝试分离培养肠黏膜上皮细胞。酶消化法于37℃分为4个处理组进行:处理1以2.5 g/L的胰蛋白酶消化30 min;处理2以0.2 g/L胶原酶Ⅰ消化70 min;处理3以50 mg/L嗜热菌蛋白酶消化50 min;处理4以50 mg/L嗜热菌蛋白酶+0.2 g/L胶原酶Ⅰ消化70 min。结果证明利用组织块培养法能成功建立新生仔猪小肠黏膜上皮细胞株,获得的上皮细胞具有较强的增殖能力,22 h内贴壁并发生分裂,6~7 d明显增殖,10~12 d汇合成单层,连续传代培养至12代,细胞基本失去上皮样特征。倒置显微镜下观察,10代前培养细胞为多角状或卵圆形,单层生长不重叠,呈铺路石状排列,11~12代细胞发生变形,间隙增大。细胞角蛋白18鉴定二者均为阳性,结果表明为新生仔猪小肠黏膜上皮细胞。本研究发现DMEM/F12培养基添加50 mL/L的胎牛血清,2 mmol/mL的Gln, 10 ng/mL的EGF,10 mL/L的胰岛素-转铁蛋白-硒( Insulin-Transferring-Selenium Supplements,ITS-G)培养细胞时,IEC增殖最快。试验中首先使用96孔板优选上皮细胞,成功避免了常规做法中由于成纤维细胞较多,上皮细胞难以纯化的问题。试验中采用两种温度尝试分别复苏组织块和IECs,发现在使用相同冻存液的前提下,在60℃条件下复苏组织块所获得细胞存活率明显高于37℃,而复苏IECs时,两者差异不大。